体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告

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　　【摘 要】细胞增殖是高等生物体最为重要的生命特征，肿瘤细胞以具有无限增殖潜能为特征。本文介绍了体外检测肿瘤细胞增殖方法研究进展，重点介绍了四种检测方法并分析了每种方法的优缺点，以期为抗肿瘤药物筛选及新药的研发提供参考。
　　【关键词】细胞增殖;肿瘤;体外检测
　　中图分类号： R446.5 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）03-0138-002
　　DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.03.058
　　A review of in vitro assay of tumor cell proliferation
　　LI Ping1，2 SHEN Xue-bin1，2 ZHOU Yu-yan1，2 LI Jiao1 HAN Jian1 WANG Guo-dong1，2
　　（1.Wannan Medical College， Wuhu Anhui 241002， China;
　　2.Anhui Provincial Engineering Research Center for Polysaccharide Drugs， Wuhu Anhui 241002， China;
　　3.Anhui Provincial Key Laboratory of Active Biological Macro-molecules， Wuhu Anhui 241002， China）
　　【Abstract】Cell proliferation is the most important life feature of advanced organisms， and cancer cells are characterized by unlimited proliferation potential. This paper introduces the research progress of detection methods of tumor cell proliferation in vitro， focusing on the advantages and disadvantages of each method， in order to provide reference for the screening of anti-tumor drugs and the research and development of new drugs.
　　【Key words】Cell proliferation; Ccancer; In vitro detection
　　癌细胞最基本的特点就是具备无限增殖的潜能[1]。持久的增殖信号是肿瘤的主要特征之一，正常组织可以精准控制促细胞生长信号的生成和释放，从而指导细胞增殖分化周期性进行，维持细胞数量的平衡，但肿瘤细胞本身可产生生长因子受体，从而不能实现负反馈调节，表现为持续的增殖信号刺激，无限的分裂增殖[2-3]。细胞的增殖需要染色体末端的端粒参与，正常细胞中端粒随着增殖逐渐变短，而无限增殖的肿瘤细胞中存在端粒末端转移酶，该酶只在肿瘤细胞中高表达，并且可以将端粒重复片段加端粒DNA的末端，阻止的肿瘤细胞进入衰老和凋亡[4-6]。因此检测肿瘤细胞的增殖是评价抗肿瘤药物是否有效的重要指标[7]。体外细胞实验因方便快捷，越来越受到青睐。本文主要综述体外检测肿瘤细胞增殖方法并对每种方法的优缺点加以简单的分析。
　　1 比色法
　　1.1 MTT法[8]
　　四唑盐（MTT）法是最为经典的检测肿瘤细胞增殖的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够使外源性四唑盐还原为水不溶性的蓝紫色結晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞不具备该能力没有这个现象。细胞到达设定的检测时间后，加入MTT置于细胞培养箱内37℃孵育4h，吸弃培养基后，使用DMSO溶解细胞中的甲瓒，酶标仪570nm测定吸光度值，可通过实验组吸光度与空白对照组吸光度比值间接反映肿瘤细胞增殖活力。
　　1.2 WST-1法[9]
　　WST-1是MTT的类似化合物是MTT的一种升级替代产品，在电子耦合试剂存在时，可被线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。MTT被琥珀酸脱氢酶还原生成的formazan结晶不融于水溶，需要DMSO或特定的溶解液来溶解;而众所周知DMSO常温下对人体有细胞毒性。而WST-1产生的formazan却是水溶性的，不但可以省去溶解步骤，节约了时间而且减少了有毒物质的使用，更加的安全。另外，WST-1比MT拥有更宽的线性范围更高的灵敏度，但它需要配合电子耦合试剂使用。
　　1.3 CCK-8法[10]
　　CCK-8法是对MTT法的进一步改良，不需要吸弃培养基，可直接加入原培养基体积百分之10的CCK-8溶液，培养箱孵育0.5-4h，可直接酶标仪450nm检测吸光度。该方法减少了实验步骤，可减少人为误差。孵育时间一般1h，较MTT法时间大为缩短，并且可在不同时间点多次进行扫描，数据更为准确，但该试剂价格较MTT昂贵，且颜色与培养基颜色相近，容易导致漏加。
　　1.4 SRB法[11]
　　SRB法需每孔先加入三氯乙酸，4°C冰箱孵育1h后弃孔内液体，蒸馏水洗涤后，空气中干燥至。每孔加入100mL SRB，室温静置染色30min，弃染液后用1%乙酸冲洗。空气中干燥后每孔加150μL，10mmol/L Tris base（pH=10.5），于振荡器上震荡5min，使完全溶解，酶标仪490nm处测定吸光度。该方法使用的试剂较多，操作也较为繁琐，但细胞固定染色后可以放置较长时间。用Tris-base溶液溶解的SRB也可稳定较长时间。因此不同时间点固定的细胞培养板可在同一时间进行酶标仪扫描测定。因此SRB法在检测时间受时间的限制最小。 　　2 染色法
　　2.1 Brdu 染色法[12]
　　Brdu 染色法是另一种经常用于检测肿瘤细胞增殖的经典方法。Brdu 是胸腺密啶的衍生物， 可以标记活细胞中新合成的 DNA，可以代替胸腺嘧啶，选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。这种渗入可以稳定存在，随着 DNA 的复制，Brdu 可以进入子代细胞中。Brdu 特异性抗体可以用于检测 Brdu 在细胞 DNA 中的渗入，从而判断细胞增殖能力的变化。通常在使用 Brdu 单克隆抗体之后，都会结合免疫荧光染色，显示增殖的细胞，同时结合其他细胞标记物，进行双重染色，可以判断增殖细胞的种类，增殖细胞的增殖速度，对研究细胞动力学有重要的意义 。另外，通过 Brdu 染色法可以通过荧光拍照获得影像数据，与比色法相比较数据更为丰富有层次。
　　2.2 EdU染色法
　　EdU染色法与Brdu 染色法这两种方法原理类似，但是Brdu 染色法需要用到抗体，方法步骤繁琐，受到的干扰多，因此EdU法目前已逐渐替代原来的Brdu 染色法，该方法处理后，EdU被Alexa Fluor 488等荧光标记物标记，增殖的细胞在荧光显微镜下发出特定荧光，因此可检测到单细胞的增殖，可以快速便捷的检测肿瘤细胞增殖。
　　3 实时细胞分析法[13]
　　前面介绍的方法，皆是终点观测，不能够对细胞增殖情况进行持续性实时观测，为了达到实时观测细胞增殖的目的，有公司研发了实时细胞分析仪（RTCA），该仪器使用特定的细胞培养板， 板中的每个孔底带有特制电极。当细胞在孔内发生粘附，转移，增殖的时候，孔内的电阻抗发生变化，被电极实时记录，从而获得了相關的实时数据。RTCA不仅能够获得关键时间点的细胞增殖数据，而且还可以获得在整个培养周期内的细胞增殖动力学变化过程。 但是该方法需要购买实时细胞分析仪，并且使用的特定细胞培养板价格昂贵，一定程度上限制了该方法的应用。
　　4 克隆形成实验[14]
　　肿瘤细胞由于恶性程度高，因而还具有一类被称为克隆形成能力特殊的增殖能力。
　　克隆形成实验的大致流程是，在6孔板内加入含100-500个肿瘤细胞完全培养基，7-14d后弃去培养液，PBS洗涤2次，每孔加入100%甲醇1mL，固定细胞10min。弃去甲醇，每孔加入0.5%结晶紫溶液1mL，室温染色30min后，小心吸除结晶紫溶液，清水洗板，倒置空气干燥。检测超过50个细胞的克隆数。该实验与之前介绍的比色法、染色法、实时细胞分析法可以互为补充。
　　5 总结
　　综上所述， 体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法主要分为四类：（1）比色法：MTT法、WST-1、CCK-8法、SRB法等;（2）Brdu 染色法;（3）实时细胞分析法;（4）克隆形成实验。每种测定方法各有优缺点。以MTT法为代表的比色法，成本低廉，易于复制，染色法则在得到数据的同时可以获得图片资料，但这两类方法只能检测固定的时间点。而实时细胞分析法在方法上更为先进，获取的数据也更为详实，却需特定检测设备及耗材。 在抗肿瘤药物筛选中，体外检测肿瘤细胞增殖可以说是必做的实验，因有些方法虽然好但可能会受制于高昂的设备及耗材而无法进行，因此可以根据各实验室的具体条件，选择适合自身的方法进行实验。
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