岗梅根和茎超临界CO2萃取物中低极性挥发性成分比较及其对IEC—6细胞增殖活性的影响

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　　摘 要 目的：比较岗梅根和茎的超临界CO2萃取物中的低极性挥发性化学成分及其体外对大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6增殖活性的影响，为充分利用岗梅野生资源和扩大其药用部位提供参考。方法：采用超临界CO2萃取法提取岗梅根和茎中的低极性挥发性化学成分，通过气质联用法（GC-MS）分析其化学成分组成。以IEC-6细胞为对象，采用不同质量浓度的岗梅根或茎超临界CO2萃取物（0、1、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL）处理细胞，以MTT法检测细胞相对活力，绘制细胞增殖曲线图并计算各萃取物的半数有效浓度（EC50）。结果：通过GC-MS分析技术从岗梅根和茎超临界CO2萃取物中分别鉴定出62、46个低极性挥发性化学成分，其中共有成分24个，主要为壬酸（根、茎中分别含14.18%、6.14%）、辛酸（根、茎中分别含10.59%、4.35%）、己酸（根、茎中分别含8.63%、10.86%）、丹皮酚（根、茎中分别含7.79%、6.00%）、2-甲基-3-苯基-丙醇（根、茎中分别含6.30%、0.58%）、乙酸（根、茎中分别含1.72%、33.77%）等。细胞体外试验结果显示，岗梅根和茎超临界CO2萃取物质量浓度较低（≤60 μg/mL）时，能显著促进IEC-6细胞增殖，EC50分别为16.35、20.20 μg/mL；而当质量浓度较高（≥80 μg/mL）时，则表现出细胞毒活性，对IEC-6细胞增殖呈抑制作用。結论：岗梅根和茎中的低极性挥发性化学成分种类相似，其萃取物对IEC-6细胞的体外生物活性也相似；短链脂肪酸很可能是其促进细胞增殖的活性成分，而丹皮酚则可能是其细胞毒活性成分。
　　关键词 岗梅；根；茎；低级性；挥发性成分；超临界CO2萃取；气质联用；IEC-6细胞；细胞增殖
　　Comparison of Low-polarity Volatile Constituents in Supercritical CO2 Extract from the Roots and Stem of Ilex asprella and Its Effects on the Proliferation of IEC-6 Cells
　　MA Hongyan，WANG Tiancheng，LI Wuguo，LIU Jiawei（Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering， Guangzhou University of TCM/Key Lab of Chinese Medicinal Resource from Lingnan/ Lingnan Pharmaceutical Research and Development Laboratory， National Center for Engineering and Technology of Chinese Patent Medicine， Guangzhou 510006， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To compare low-polarity volatile constituents in supercritical CO2 extract from the roots and stem of Ilex asprella and its effects on the proliferation of IEC-6 in vitro， and to provide reference for making full use of wild resources of I. asprella and expanding its medicinal parts. METHODS： The low-polarity volatile constituents were extracted from the root and stem of I. asprella with supercritical fluid CO2 extraction（SFE-CO2）. The chemical constituents were analyzed by GC-MS. IEC-6 cells were treated with different concentrations of supercritical CO2 extracts （0， 1， 5， 10， 20， 40， 60， 80， 100 μg/mL） from roots or stems of I. asprella. MTT assay was used to detect the relative viability， and cell proliferation curve was drawn and EC50 of each extract were calculated. RESULTS： Sixty-two and forty-six low-polarity volatile constituents were identified from supercritical CO2 extract in the roots and stem of I. asprella with GC-MS； there were 24 common constituents totally， mainly including pelargonic acid（14.18% and 6.14%），octanoic acid（10.59% and 4.35%），hexanoic acid（8.63% and 10.86%），paeonol（7.79% and 6.00%），2-methyl-3-phenyl-propanal（6.3% and 0.58%），acetic acid（1.72% and 33.77%） in root and stem， respectively. The results of cell culture in vitro showed that when the concentration of supercritical CO2 extract from the roots and stems of I. asprella was lower （≤60 μg/mL）， it could significantly promote the proliferation of IEC-6 cells and their EC50 were 16.35， 20.20 μg/mL， respectively； when the concentration of the extract was higher （≥80 μg/mL）， it showed cytotoxicity and inhibited the proliferation of IEC-6 cells. CONCLUSIONS： There are similar species of volatile constituents in roots and stems of I. asprella and similar in vitro bioactivity of the supercritical CO2 extracts to IEC-6 cells. The short-chain fatty acids may be the active ingredient to promote cell proliferation， while paeonol may be the cytotoxic active ingredient. 　　KEYWORDS Ilex asprella； Root； Stem； Low polarity； Volatile constituents； SFE-CO2； GC-MS； IEC-6 cell； Cell proliferation
　　岗梅为冬青科冬青属落叶灌木梅叶冬青[Ilex asprella（Hook. et Arn.）Champ. ex Benth]，属于多年生木本植物，生于海拔400～1 000 m的山地疏林中或路旁灌丛中，主产于我国浙江、江西、福建、湖南、广东、广西、香港、台湾等地，在菲律宾群岛等东南亚地区也有分布[1]。岗梅传统药用部位为其根部，传统医学认为岗梅根入药能清热解毒、活血生津，常用于防治风热感冒、上呼吸道感染等疾病[2-3]。现代药理研究表明，岗梅根提取物及其分离化合物具有抗病毒、抗炎、肿瘤细胞毒性、调节脂质代谢等生物活性[4-6]。岗梅根为三九感冒灵、王老吉和加多宝等中成药及凉茶饮品的主要原料，是岭南地区大宗药材之一，在药材市场的需求量日益剧增，使得野生岗梅被过度采伐，其植物资源逐年减少，其藥材资源严重匮乏，难以满足临床需求。已有研究显示，岗梅根主要含有三萜酸、三萜皂苷、黄酮等极性化学成分，而岗梅茎所含化学成分与根相似[6-10]。然而岗梅根和茎中的低极性挥发性成分研究鲜有报道。为了扩大岗梅药用部位，充分开发利用岗梅药材资源，本课题通过超临界CO2萃取岗梅根和茎中的低极性挥发性成分，以气质联用法（GC-MS）鉴定并比较其化学成分异同，进一步评价其对大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6增殖活性的影响，以期为扩大岗梅药用部位提供科学依据。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　HA121-50-05型超临界流体萃取仪（江苏华安科研仪器有限公司）；R-1001N型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；ME204型万分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；XR205SM-DR型十万分之一电子天平（瑞士Precisa公司）；Voyager型GC-MS联用仪（美国Finnigan公司）；3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CKX41型相差倒置显微镜（日本Olympus公司）；TC10型细胞计数仪、iMark型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；TGL-16G型高速台式离心机（上海安亭科学仪器公司）。
　　1.2 药材与试剂
　　岗梅药材于2012年11月采于广东从化市三垭塘，经广州中医药大学中药学院药用植物教研室彭光天博士鉴定为冬青科冬青属植物梅叶冬青[Ilex asprella（Hook. et Arn.）Champ. ex Benth]的干燥根和茎。
　　DMEM培养基（批号：C11995）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，批号：C10010）、胎牛血清（FBS，批号：10099）、0.25%Trypsin-EDTA（批号：25200）、青-链霉素双抗溶液（批号：15140）均为美国Gibco公司产品；CO2（上海源叶生物科技有限公司，纯度：99.999%）；MTT（美国Sigma公司，批号：M2128）；95%乙醇、无水硫酸钠、二甲基亚砜（DMSO）、乙醚等试剂均为分析纯，水为双蒸水。
　　1.3 细胞
　　大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6细胞株由广州中医药大学脾胃研究所李茹柳研究员惠赠，液氮保存。
　　2 方法
　　2.1 岗梅根和茎的超临界CO2萃取
　　取岗梅根510 g、茎505 g，粉碎，过50目筛，装入超临界萃取釜中。采用经前期预试验优化所得工艺参数进行超临界CO2萃取：萃取压力为20 MPa、萃取温度为45 ℃，加入一定量95%乙醇作为夹带剂，萃取时间为2 h。其中分离釜Ⅰ的温度为45 ℃，压力为5.4 MPa；分离釜Ⅱ的温度为50 ℃，压力为5.4 MPa。
　　2.2 岗梅根和茎超临界CO2萃取物的GC-MS分析
　　2.2.1 样品溶液的制备 将“2.1”项下所得超临界CO2萃取物在45 ℃下旋转蒸发回收乙醇，得提取物浸膏。取适量浸膏，用乙醚配制成50 mg/mL（按浸膏质量计算）的溶液，加适量无水Na2SO4脱水干燥，经0.45 μm微孔滤膜滤过。取滤液备用于GC-MS分析检测。
　　2.2.2 色谱条件 色谱柱为TG WAXMS石英毛细管色谱柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：初始温度40 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升至200 ℃，立刻以10 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；进样口温度为220 ℃；载气为高纯度氮气，载气体积流量为2 mL/min（恒流模式）；分流进样，分流比为15 ∶ 1；进样量为1 μL。
　　2.2.3 质谱条件 离子源温度为200 ℃；接口温度为240 ℃；电离子为电子轰击（EI）源，电子轰击能量为70 eV；扫描方式为Full Scan，扫描速度为1 975.50 amu/s，扫描范围为19～450 amu，溶剂延迟时间为3 min。
　　2.2.4 低极性挥发性成分的相对含量计算 采用NIST Search 2.0质谱数据库软件对化学成分进行检索匹配，并结合相关文献，人工解析质谱图谱，鉴定并确证化合物结构；采用峰面积归一法计算各化学成分的相对百分含量。
　　2.3 岗梅根和茎超临界CO2萃取物对IEC-6细胞增殖活性的影响考察
　　2.3.1 细胞复苏及培养 取液氮保存的IEC-6细胞，在37 ℃水浴中解冻（≤1 min），加入4～6 mL完全培养液（含10%FBS+双抗的DMEM培养基）中，1 000 r/min离心5 min。弃去上清液，重悬细胞，接种于培养瓶，在37 ℃、5%CO2条件下培养，次日换液。待细胞生长至约80%融合时，用0.25%Trypsin-EDTA 1 mL消化传代，备用。 　　2.3.2 萃取物对细胞增殖活性的影响考察 采用MTT法进行检测。取对数生长期细胞进行消化计数，然后按1×104个/孔接种于96孔板，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。将细胞分为空白对照组和给药组，每组平行设置3个孔。吸弃各孔中的完全培养液，空白对照组加入含0.4%DMSO+10%FBS的DMEM培养基200 μL，给药组加入含梯度质量浓度的岗梅根或茎萃取物（终质量浓度分别为0、1、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL，按浸膏质量计算，剂量根据预试验结果制定）的完全培养液200 μL，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。培养完毕后，每孔加入0.5 mg/mL MTT溶液（以PBS为溶剂配制）20 μL，继续培养4 h后吸弃培养基，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min。采用酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度（OD）值，以此表示细胞相对活力；同时，以药物浓度对数值为横坐标、相对细胞活力为纵坐标，采用GraphPad Prism软件绘制细胞增殖曲线并计算各萃取物的半数有效浓度（EC50）。
　　3 结果
　　3.1 超临界CO2萃取物的GC-MS分析结果
　　3.1.1 岗梅根 经超临界CO2流体萃取得到岗梅根萃取物3.29 g，产率为0.65%。经GC-MS分析，共分离得到70个峰。鉴定并确证其中62个化合物的结构，按面积归一化法计算，这62个化合物含量之和占检出化学成分总量的相对百分含量为97.70%；其中的主要成分为2-甲基-3-苯基-丙醇（2-methyl-3-phenyl-propanal）、己酸（Hexanoic acid）、庚酸（Heptylic acid）、辛酸（Octanoic acid）、壬酸（Pelargonic acid）和丹皮酚（Paeonol）等，分别占检出化学成分总量的6.30%、8.65%、3.58%、10.59%、14.18%和7.79%。岗梅根超临界CO2萃取物的总离子流图谱见图1A，GC-MS分析结果见表1。
　　3.1.2 岗梅茎 经超临界CO2流体萃取得到岗梅茎萃取物1.39 g，产率为0.28%。经GC-MS分析，共分离得到53个峰。鉴定并确证其中46个化合物的结构，按面积归一化法计算，这46个化合物含量之和占检出化学成分总量的相对百分含量为94.46%；其中的主要成分为乙酸（Acetic acid）、己酸（Hexanoic acid）、辛酸（Octanoic acid）、壬酸（Pelargonic acid）和丹皮酚（Paeonol）等，分别占检出化学成分总量的33.77%、10.86%、4.35%、6.14%和6.00%。岗梅茎超临界CO2萃取物的总离子流图谱见图1B，GC-MS分析结果见表1。
　　3.2 超临界CO2萃取物对IEC-6细胞增殖活性的影响考察结果
　　结果显示，质量浓度为1～60 μg/mL的岗梅根和茎超临界CO2萃取物进行处理后，细胞相对活力随药物质量浓度升高而升高，表明上述质量浓度的萃取物能促进细胞增殖，且呈量效关系，其EC50分别为16.35、20.20 μg/mL；但当质量浓度为80～100 μg/mL的萃取物进行处理后，细胞相对活力随药物质量浓度升高而降低，表明两者均能抑制细胞增殖活性，表现出一定的细胞毒活性。不同质量浓度岗梅根和茎超临界CO2萃取物作用下的细胞增殖曲线见图2。
　　4 讨论
　　岗梅为岭南地区地产药材，以根入药，是多种中成药和保健品饮料的重要原料。但岗梅生长缓慢、药材产量低，加之目前对其野生资源的过度采伐，导致其药材资源严重匮乏、日趋濒危。因此，扩大岗梅药用部位成为解决上述问题的思路之一。已有研究证实，岗梅根和茎中含有相似种类的极性化学成分[6-10]。为进一步探讨岗梅根和茎所含化学成分的异同，本研究分析比较了两者所含低极性挥发性化学成分，并评价了其萃取物在体外对IEC-6细胞增殖活性的影响。
　　本研究采用超临界CO2萃取岗梅根和茎的低极性挥发性成分，利用GC-MS法分析鉴定其化合物结构，从岗梅根和茎中分别鉴定并确证了62、46个化合物，分别占总检出化学成分的97.54%、96.54%，这些化合物均主要为有机酸类、萜类、醇类、酯类和酮类等；两者的共有成分有24个，分别共占总检出化学成分的相对百分含量为72.48%、75.87%，均包括壬酸、辛酸、己酸、丹皮酚、2-甲基-3-苯基-丙醇、乙酸等共有成分，表明岗梅根和茎的低极性挥发性化学成分种类和含量相似。
　　体外细胞试验结果显示，岗梅根和茎的超临界CO2萃取物质量浓度≤60 μg/mL时，能显著促进IEC-6细胞增殖；而当萃取物质量浓度≥80 μg/mL时，则表现出明显细胞毒性，对IEC-6细胞增殖呈抑制作用。通过GC-MS分析表明，岗梅根和茎超临界CO2萃取物均含有较丰富的挥发性短链脂肪酸如乙酸、己酸、辛酸和戊酸等。研究表明，這些短链脂肪酸具有营养肠生理作用，是肠上皮细胞的主要能量来源[11]；辛酸是低分子量脂肪酸，具有促进P12神经细胞神经突触成长的活性[12]；戊酸能促进仓鼠卵巢细胞（CHO）的蛋白质合成和细胞增殖[13]。较高含量的短链脂肪酸很可能是岗梅根和茎超临界CO2萃取物中促进IEC-6细胞增殖的活性成分，也可能是岗梅的药效物质基础。与此同时，丹皮酚也是岗梅根和茎超临界CO2萃取物中相对含量较高的化学成分，分别占7.79%、6.00%，该化合物很可能是萃取物中的细胞毒活性物质基础。研究证明，丹皮酚能通过下调ErbB2并抑制核因子κB（NF-κB）信号通路，从而抑制胃癌细胞SGC-7901细胞增殖、诱导细胞凋亡[14]；还能通过抑制金属基质蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9的表达水平，从而抑制胃癌细胞 BGC823 的增殖、迁移和侵袭[15]。据此推测，丹皮酚可能也是岗梅根和茎的药效物质基础，有待后续进一步深入研究。 　　综上所述，岗梅根和茎中所含低极性挥发性化学成分种类相似，其超临界CO2萃取物对IEC-6细胞增殖活性的影响作用也相似。本研究可为扩大岗梅药用部位和充分利用其野生资源提供参考。
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　　（收稿日期：2018-11-28 修回日期：2019-02-26）
　　（編辑：段思怡）
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