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癌性血性胸水TIL细胞体外培养研究

作者:未知

  【摘要】 目的 探究癌性血性胸水肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在体外培养的状况。方法 使用四甲基偶氮唑盐(MTT)手段对TIL细胞体外细胞活性进行检测, 使用酶联免疫(ELISA)手段对白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-7(IL-7)及白细胞介素-21(IL-21)水平进行观察, 将IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平较低的患者分为观察组(20例), 将IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平较高的患者分为对照组(20例)。观察并比较两组患者胸水TIL细胞体外增殖情况及杀瘤活性。结果 观察组TIL细胞体外培养8 d后TIL细胞体外增殖(58.4±27.3)倍, 培养12 d后TIL细胞体外增殖扩增为(107.6±44.2)倍, 明显高于对照组的(22.4±11.2)、(66.7±32.4)倍, 差异具有统计学意义(P<0.05)。观察组TIL细胞体外杀瘤活性(44.7±9.3)%明显高于对照组的(24.5±6.7)%, 差異具有统计学意义(P<0.05)。结论 癌性血性胸水患者中, IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平高低同TIL细胞体外增殖速度及杀瘤活性明显存在一定的关联性, IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平较低的患者胸水TIL细胞体外增殖速度较快, 杀瘤活性较强。胸水IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平可以作为癌性血性胸水患者临床免疫治疗的参考。
  【关键词】 肿瘤浸润淋巴细胞;抗肿瘤治疗;癌性血性胸水;体外培养
  DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.02.115
  肿瘤浸润淋巴细胞是从淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、杀伤细胞(CIK)之后出现的又一种新型的抗肿瘤效应细胞, 因为肿瘤浸润淋巴细胞的抗瘤活性较强, 回输后可以特异性集聚在患者肿瘤位置处, 并可以在IL-2存在下进行体外的培养与扩增, 逐渐被应用在抗临床肿瘤治疗中[1-3]。有研究发现, 胸水中IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平与TIL细胞的体外扩增及TIL细胞的杀瘤活性有一定关系[4]。本文主要探究患者胸水中IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平对其TIL细胞在体外培养的影响, 现报告如下。
  1 资料与方法
  1. 1 一般资料 选择2016年1月~2018年1月本院收治的40例癌性血性胸水患者, 年龄39~67岁, 平均年龄(56.18±5.52)岁, 所有患者均通过病理学或细胞学诊断, 确诊为癌性胸水, 胸水量范围在中等以上(>200 ml), 且未接受癌性血性胸水的其他常规性治疗, 患者生存预期>3个月。使用ELISA手段对患者胸水IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平进行检测, 将所有患者按细胞因子水平高低分为两组, 将IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平较高的20例患者分为对照组, 将IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平较低的20例患者分为观察组。
  1. 2 方法
  1. 2. 1 制备方法 无菌条件下收集患者胸水500~1000 ml, 按1∶100的比例加入肝素抗凝, 并使用离心、贴壁分离等手段分离, 并获得上清与TIL细胞。具体步骤如下:通过
  2000 r/min离心10 min, 获取上清。使用PBS洗涤细胞2次, 然后再悬在20 ml的PBS中。在两个15 ml离心管内加入淋巴细胞分离液体5 ml, 并小心添加上述细胞悬液各10 ml, 2000 r/min离心20 min, 淋巴细胞分离液界面上对云雾样细胞层细胞进行收集, PBS离心洗涤细胞, 按1∶10的体积添加红细胞裂解液裂解5 min, PBS洗涤细胞1次, 培养液洗涤1次, 加入含10%的牛血清的培养液并转移到175 cm2培养瓶中, 在37℃, 5% CO2的培养箱中静置培养40 min。轻摇培养瓶, 取悬浮细胞培养TIL细胞, 贴壁细胞培养肿瘤细胞。
  1. 2. 2 TIL细胞体外培养及其增殖能力测定 用含IL-2 的500 U/ml的10%牛血清培养液把TIL细胞调整为浓度5×
  105个/ml, 转移到预包被CD3单抗的6孔板中, 在37℃、5% CO2的培养箱中培养, 每隔48 h添加倍量的培养液进行扩增。每96 h对TIL细胞增殖数量进行常规计数。
  1. 2. 3 MTT法检测TIL细胞体外杀瘤活性 使用MTT法检测TIL细胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性。将TIL细胞和肿瘤细胞浓度分别调整为2×106个/ml。两者按10∶1混合, 并设立效应细胞和靶细胞对照, 在37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h, 加入MTT再培养2 h, 加入DMSO混匀。酶标仪测定OD值, 并计算TIL细胞杀瘤活性:TIL细胞活性=[1-(实验组OD值-效应细胞组OD值)/靶细胞OD值]×100.0%。
  1. 3 观察指标 观察两组患者TIL细胞体外增殖能力及其体外杀瘤活性。
  1. 4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
  2 结果
  2. 1 两组患者TIL细胞体外增殖能力比较 观察组TIL细胞体外培养8 d后TIL细胞体外增殖(58.4±27.3)倍, 培养12 d后TIL细胞体外增殖扩增为(107.6±44.2)倍, 明显高于对照组的(22.4±11.2)、(66.7±32.4)倍, 差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。
  2. 2 两组患者TIL细胞体外杀瘤活性比较 观察组TIL细胞体外杀瘤活性(44.7±9.3)%明显高于对照组的(24.5±6.7)%, 差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。   3 討论
  晚期恶性肿瘤常伴有恶性胸腔积液, 这与肿瘤胸膜转移密切相关。临床上常用平阳霉素(BLM)、丝裂霉素C(MMC)及顺铂 (DDP)等化疗药物行胸腔内注射治疗[4]。但大多患者由于病期较晚、身体状况较差, 其临床治疗效果并不佳, 而且不良反应也较大[5]。而TIL细胞来自于患者肿瘤引流淋巴结、恶性胸腔积液、实体瘤以及腹水, 通过诱导并激活, 其存在着很大的优势:①具有较强的抗肿瘤效应。患者恶性肿瘤间质中含有TIL细胞, 具有一定的靶细胞特异性, 在体外激活扩增后可以特异性杀伤肿瘤细胞, 其杀瘤活性强于LAK细胞50~100倍[6-8]。②TIL细胞能够聚集至肿瘤处, 并对自体肿瘤细胞存在着特异杀伤活性。患者肿瘤内TIL细胞含量越多, 预后越佳, 这说明TIL细胞在抗肿瘤中发挥着重要作用。由于TIL细胞对恶性肿瘤的治疗作用, 已经成为国内外恶性肿瘤免疫治疗的一项备受关注的热点。本文主要研究癌性血性胸水患者IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平对其TIL细胞在体外培养的影响。经探究表明, 观察组TIL细胞体外培养8 d后TIL细胞体外增殖(58.4±27.3)倍, 培养12 d后TIL细胞体外增殖扩增为(107.6±44.2)倍, 明显高于对照组的(22.4±11.2)、(66.7±32.4)倍, 差异具有统计学意义(P<0.05)。观察组TIL细胞体外杀瘤活性(44.7±9.3)%明显高于对照组的(24.5±6.7)%, 差异具有统计学意义(P<0.05)。本结果提示了IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平较低的患者胸水中分离出的TIL细胞增殖速度较快, 且具有较强的抗肿瘤活性。这是因为IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平较低的患者体内细胞因子水平较低, 对体内淋巴细胞的增殖与激活有一定的影响, 进而使其体内TIL、细胞毒T淋巴细胞 (CTL)以及自然杀伤细胞(NK)等免疫细胞的增殖速度变慢, 杀瘤活性也随之变低。在体外培养TIL细胞时, 由于给予充分的细胞因子, TIL细胞抗肿瘤活性也会加大, 并且细胞增殖速率也会提高。而对于IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平较高的患者, 可能存在细胞因子与淋巴细胞间传递信息上的障碍, 进而使淋巴细胞对其反应性变差, 因此, TIL在体外增殖速率降低, 其体外杀瘤活性的能力变差。综上所述, 在治疗癌性血性胸水患者前, 检测IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平可以为是否适合实施TIL细胞免疫治疗提供一定的临床依据。
  参考文献
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  [8] 袁泉纯. 肿瘤浸润性淋巴细胞治疗癌性胸腹水的临床应用与护理. 中国临床护理, 2010, 2(2):99-100.
  [收稿日期:2018-10-18]
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