高效解磷细菌菌株CT45-1的鉴定及其对烟草的促生作用

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　　摘要：使用以Ca3（PO4）2为唯一磷源的NBRIP液体培养基，对一株来源于潍坊烟区根际土壤的高效解磷细菌菌株CT45-1的解磷能力进行定量测定分析，并利用分子生物学方法对该菌株进行鉴定;通过盆栽试验，了解菌株CT45-1对烟株的促生作用。定量分析结果表明，随着培养时间的增加，接种菌株CT45-1的液体培养基中可溶性磷含量先增加后降低并趋于稳定，振荡培养48 h后，培养液中可溶性磷含量最高，为246.99 mg/L;培养过程中pH值先降低后升高，然后趋于稳定，48 h 时pH值最小（3.17）。经recA 序列分析，将CT45-1鉴定为新洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cenocepacia）。盆栽试验结果表明，不同处理浓度的CT45-1菌液处理烟株后，其株高、鲜重均显著高于对照，植株全磷含量分别比对照高30.28%、22.40%。
　　关键词：烟草根系;解磷细菌;鉴定;可溶性磷含量;促生作用
　　中图分类号：S154.39文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）04-0074-05
　　Abstract The NBRIP liquid medium with Ca3（PO4）2 as the sole phosphorus source was used to quantitatively analyze the phosphate-dissolving ability of a high-efficiency phosphate-dissolving bacterial strain CT45-1 separated from the rhizosphere soil of Weifang tobacco-growing area. The strain was identified by molecular biological method， and its promoting-effect on tobacco growth was studied by pot experiment. The results of quantitative analysis showed that， with the increase of culture time， the soluble phosphorus content in the liquid medium with inoculated strain CT45-1 increased firstly， then decreased and tended to be stable. After 48 hours of shaking culture， the soluble phosphorus in the culture solution had the highest content as 246.99 mg/L. The pH value decreased firstly， then rose and stabilized during the culture. The pH value as 3.17 was minimum at the 48th h. The strain CT45-1 was identified as a new Burkholderia cenocepacia by recA sequence analysis. The results of pot experiment showed that the plant height and fresh weight of tobacco treated by two concentrations of CT45-1 bacterial solution were significantly higher than those of the control， and the total phosphorus content of the two treatments were 30.28% and 22.40% higher than that of the control.
　　Keywords Tobacco root; Phosphate-dissolving bacteria; Identification; Soluble phosphorus content; Promoting effect on growth
　　磷是植物正常生長发育不可缺少的元素，在植物新陈代谢中起着重要作用。但土壤中可溶性磷的浓度一般很低，通常在1 mmol/L或更少[1]，因此不能满足农作物高产的需要。为提高作物产量和品质，农户往往每年施入大量磷肥，施入土壤后可溶性磷的大部分很快发生专性吸附和化学沉淀固定，转变成植物难以吸收利用的无效态磷[2]。可见，土壤中被固定的无效态磷的分解、释放对于提高土壤中的可溶性磷含量具有重要意义。
　　 研究表明，解磷微生物在土壤磷循环系统中担任重要角色，可将难溶性磷转化为植物可吸收利用的可溶性磷，尤其是在植物根际，部分解磷微生物还起到一定的促生作用[3-6]。在自然环境中，植物根际土壤中存在大量具有不同解磷能力的微生物，如细菌、真菌和放线菌等，其中解磷细菌占1%～50%，而解磷真菌只占0.1%～0.5%[7];真菌、放线菌的解磷能力一般强于细菌[8]，但是，解磷真菌、放线菌的种类及数量远不如解磷细菌[9]。这类微生物可以通过自身代谢产物或与其他生物协同溶解土壤中的难溶性无机磷，以增加土壤中有效磷的含量，从而提高土壤磷利用率[10， 11]，被称为溶磷微生物 （PSM），这种溶磷现象称为矿物溶磷 （MPS）现象。
　　 具有解磷能力的细菌种类很多，主要有芽孢杆菌属 （Bacillus）、伯克霍尔德菌属 （Burkholderia）、假单胞菌属 （Pseudomonas）、固氮菌属 （Azotobacter）、埃希氏菌属 （Escherichia）、土壤杆菌属 （Agrobacterium）、肠杆菌属 （Enterbacter）、沙雷氏菌属 （Serratia）、黄杆菌属 （Flavobacterium）、欧文氏菌属 （Erwinia）等。 　　 前期研究从烟株根际土壤中分离、筛选获得一株高效溶解无机磷细菌菌株CT45-1，该菌株在Pikovaskaia’s（PVK）培养基平板上的解磷圈直径 （D） 与菌落直径 （d） 比值 （D/d）大于2.0，显示出较强的解磷能力。本研究拟进一步探讨菌株CT45-1的解磷能力，同时通过菌株的recA基因序列分析，确定该菌株的分类地位，以期为解磷微生物的开发和应用提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试材料
　　 菌株：菌株CT45-1分离自潍坊市昌乐县鄌郚镇烟田的根际土壤，通过初步筛选具有较好的溶解Ca3（PO4）2的能力。
　　 培养基：NB培养基，用于细菌菌株的培养;以Ca3（PO4）2作为唯一磷源的液体培养基NBRIP，用于供试菌株解磷能力定量测定[12]。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 菌株CT45-1解磷能力测定 （1）种子液的制备：将菌株CT45-1在NB固体培养基上活化，置于28℃培养箱中培养48 h;取单菌落接种于NB 液体培养基中，28℃、180 r/min培养24 h，调整菌液浓度至OD600值为1.0 左右，即制得种子液。
　　（2）液体培养：将种子液按1%接种量接种于100 mL的NBRIP无机磷液体培养基中，28℃、180 r/min振荡培养168 h，同时以接种等量无菌水作对照，每处理设3次重复。
　　（3）菌株解磷能力测定：按照鲁如坤[13]研究方法制作磷标准曲线，用钼锑抗比色法[13]每24 h取样测定培养液中可溶性磷含量。采用pH计（赛多利斯pH计，PB-10）测定pH值。
　　1.2.2 菌株CT45-1对烟株生长能力的影响 供试烟苗：NC55，6片真叶。
　　 盆栽土壤取自山东农业大学南校区试验田，过40目筛子后灭菌（160℃高压灭菌12 h）使用。
　　 盆栽土壤养分状况：碱解氮67.00 mg/kg，有效磷120.70 mg/kg，速效钾212.75 mg/kg，氯43.60 mg/kg，有机质14.07 g/kg。pH=7.62。
　　 供试菌株活化后在NB 液体培养基中培养12 h左右，离心 （6 000 r/min，15 min） 收集菌体，用无菌水悬浮离心，清洗2 次后稀释到OD600为1.0（菌体浓度约为1.0×106 cfu/mL）。将生长一致的健壮烟苗移栽到花盆中（盆高15.7 cm，上沿口直径12.9 cm，盆底直径8.0 cm），每盆1棵烟苗，装土样2 kg左右，试验共设3个处理：
　　 CK： 400 mg （浓度200 mg/kg） Ca3（PO4）2 + 10 mL无菌水;
　　 T1： 400 mg （浓度200 mg/kg） Ca3（PO4）2 + CT45-1菌液（OD600= 1.0）5 mL;
　　 T2： 400 mg （浓度200 mg/kg） Ca3（PO4）2 + CT45-1菌液（OD600= 1.0）10 mL。
　　 移栽后灌根接种，每15 d接种一次，每处理设5 次重复，45 d后收获。测定植株的鲜重、干重、株高，用消煮钼锑抗比色法测定植株全磷含量[13]。
　　1.2.3 菌株CT45-1的鉴定 形态特征观察参照《常见细菌系统鉴定手册》[14]的鉴定方法进行;分子生物学鉴定方法按照参考文献[15]。recA基因扩增引物：BCR1 （5′-TGACCGCCGAGAAGAGCAA-3′）和BCR2 （5′-CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC-3′）。扩增反应体系 （25 μL）：5 × PCR缓冲液2.5 μL，DNA模板 （50 ～ 100 ng/μL）1.0 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）2 μL，正向引物BCR1 （10 μmol/L）1.0 μL，反向引物BCR2 （10 μmol/L）1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 17 μL。扩增程序：94℃ 3 min;94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环;72℃ 10 min。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物纯化后，送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，利用BLAST程序在GenBank中进行同源性比较，并用软件MEGA 6.0构建系统发育树。
　　1.3 数据统计分析
　　 采用Microsoft Excel 2003和DPS数据统计分析软件进行分析，Duncan’s 新复极差法进行显著性差异比较。
　　2 结果与分析
　　2.1 菌株CT45-1的解磷能力定量测定
　　 菌株CT45-1在NBRIP液体培养基中振荡培养时，随培养时间的延长，培养液中可溶性磷含量先急剧增加后降低并趋于稳定，培养至24 h时可溶性磷含量急剧增加，且在48 h达到最大值（246.99 mg/L）;培养基初始pH值为6.9，培养过程中pH值均有所降低，在48 h时达到最低值（3.17），后上升并趋于稳定（图1）。
　　2.2 菌株CT45-1解磷促生效果测定
　　 由表1可知，处理T1、T2的株高和鲜重均显著高于对照，说明接种CT45-1可显著促进烟苗的生长;处理T1、T2煙株的根、茎、叶的全磷含量分别为64.97 mg/g和69.15 mg/g，与对照（53.08 mg/g）相比，分别提高22.40%、30.28%，均达差异显著水平（图2）;土壤有效磷含量分别为234.10、245.93 mg/kg，而对照仅为202.15 mg/kg。结果表明菌株CT45-1对烟草具有较好的促生作用。
　　3 讨论与结论
　　 解磷微生物在土壤磷循环系统中担任着重要角色，可将难溶性磷转化为可溶性磷，从而提高磷肥的利用率。解磷微生物广泛分布于土壤、水和植物体内，但是，在自然条件下，这些解磷微生物的数量难以与生态系统中其他微生物竞争并发挥其活性，仅仅依靠自然条件的作用不足以释放满足植物生长发育所需的磷。因此，研究人员设想在自然条件下或生物体内筛选到解磷菌株，制成菌剂后回接到土壤中以转化出足量的有效磷[16， 17]。本研究从烟草根际筛选到一株高效解无机磷细菌菌株CT45-1，钼锑抗比色法测定结果表明，该菌株对难溶性磷酸盐Ca3（PO4）2具有较好的溶解效果;结合recA基因序列分析等方法，最终将菌株CT45-1 的分类地位明确为新洋葱伯克霍尔德菌（B. cenocepacia）。 　　 关于植物根际解磷细菌的种类及其解磷作用已有许多相关报道，其中不乏具有解磷效果较好的Burkholderia sp.，如Oliveira 等[18]从玉米根际分离得到的45株解磷微生物中，以Burkholderia sp.对磷酸钙的溶解能力最强。但是，不同种类的解磷菌株或不同菌株之间的解磷能力有较大差异，如任嘉红等[19]从南方红豆杉根际土壤筛选出的几株高效解磷细菌的解磷能力较好，有效磷含量高达647.67 mg/L;陶涛等[20]筛选到4 株溶解无机磷菌株，其溶磷量为102.77～174.08 mg/L;陈俊等[21]从红树林根际土壤中筛选出具有溶解磷酸三钙的解磷细菌HN3-2，其解磷能力为90.95 mg/L。而本研究中CT45-1菌株可使培养液中可溶性磷含量达246.99 mg/L，表明此菌株溶解无机磷效果较好，有较好的应用前景。
　　 近年来，有许多关于利用解磷细菌促进作物生长的报道。Hameeda等[22]从堆肥中筛选出5株解磷细菌菌株，盆栽及大田试验均表明，接种这些菌株可以提高玉米生物量;王婧[23]研究发现，桔黄假单胞菌株JD37接种番茄后，与对照组相比，其根长、苗高、鲜重、干重均有显著提高，表明解磷细菌菌株JD37对番茄有较好的促生作用;Yu等[24]的研究表明，荧光假单胞菌显著提高了植物株高、地上部干重，增加了核桃苗对氮、磷素的吸收;程宝森等[25]的研究显示，接种解磷细菌的赤霞珠扦插苗株高、茎粗、地下干重、地上干重均比对照高，说明解磷细菌能较好地促进葡萄的生长。本研究探讨了接种菌株CT45-1对烟苗生长的影响，盆栽试验结果表明，接种该菌株能显著提高供试烟苗的株高、鲜重，促进烟苗对磷素的吸收，接种不同浓度处理烟株的磷素比对照增加22.40%～30.28%，显示出较好的应用前景。
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