马铃薯种质资源组培苗耐盐性评价与耐盐种质筛选

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　　摘要：以前期从710份种质中筛选出的29份对盐比较不敏感的马铃薯种质为材料，在含0.75% NaCl的MS培养基上培养20 d后测定组培苗的植株高度、单株根数、单株鲜重和叶片叶绿素含量，以这四个指标的测定值及其耐盐系数为评价依据，结合各指标耐盐系数及测定值隶属函数的聚类分析，对供试种质的耐盐性进行综合评价，筛选出2份耐盐性较强的种质SD400和SD751。在1.00%和1.25% NaCl胁迫下，对这2份高度耐盐种质的耐盐性进行进一步鉴定，结果表明，对1.00% NaCl胁迫仍有一定的适应性，SD400和SD751叶绿素含量分别为对照的27.52%和53.59%，株高分别为对照的21.92%和29.05%，单株根数分别为对照的26.61%和45.07%;但在1.25% NaCl胁迫下仅SD751有微量生长。
　　关键词：马铃薯;组培苗;耐盐性;综合评价;种质筛选
　　中图分类号：S532.034文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）04-0024-06
　　Abstract Using 29 salt-insensitive accessions earlier screened from 710 potato germplasm resources as materials， their plant hight， root number and fresh weight per plant and chlorophyll content were measured after cultured in MS containing 0.75% NaCl for 20 days. Based on these four indexes and their salt tolerance coefficients， the salt tolerance of the tested accessions were comprehensively evaluated by the clustering analysis of the membership function of the index value and their salt tolerance coefficients. Two highly salt-tolerant accessions， SD400 and SD751， were screened out. Their salt tolerance was identified under 1.00% and 1.25% NaCl， and the results showed that they had strong adaptability to 1.00% NaCl stress. Under 1.00% NaCl stress， the chlorophyll content of SD400 and SD751 were 27.52% and 53.59% of that of control， the plant height was 21.92% and 29.05% of that of control，and the root number per plant was 26.21% and 45.07 of that of control， respectively. SD751 also grew in a micro amount under 1.25% NaCl stress.
　　Keywords Potato; Plantlet in vitro; Salt tolerance; Comprehensive evaluation; Accession screening
　　馬铃薯是我国继水稻、小麦、玉米之后的第四大作物，是保障我国粮食安全的重要组成部分。马铃薯属于盐中度敏感作物[1]，大部分马铃薯品种在盐碱地不能正常生长，表现为植株矮小、簇生，叶片萎蔫变黄，苗期和花期延长，产量降低[2， 3]。随着我国土地盐渍化程度逐渐扩增[4]，一些马铃薯主产区的地下水含盐量上升，土壤原生盐渍化和次生盐渍化现象越来越严重[5， 6]，极大地限制了马铃薯生产。因此，筛选和培育耐盐碱品种对于促进马铃薯产业发展、提高产量和盐碱地利用率，具有十分重要的现实意义。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　前期对710份马铃薯种质试管苗进行初步离体筛选，得到29份对0.75% NaCl具有一定耐性的材料，本试验即以这29份马铃薯种质为试验材料，见表1。
　　1.2 试验设计与方法
　　1.2.1 马铃薯种质耐盐性评价 采用单因素试验设计，在0.75% NaCl[3]条件下对29份种质的耐盐性进行评价。
　　首先以MS为基本培养基，对29份种质进行组培扩繁。培养20 d后选取生理状态一致的组培苗，去掉顶芽，将植株切成含有一个腋芽的1 cm长茎段，接种至含有0.75% NaCl的MS培养基中，以不含NaCl的MS培养基为对照。每瓶接5段，每处理3瓶。在2 000 lx、12 h/d光照条件下培养20 d后测定组培苗株高、单株根数、单株鲜重和叶片叶绿素含量。叶绿素含量采用叶绿素仪SPAD 520测定。
　　根据耐盐系数=盐胁迫下某一指标的测定值/非盐胁迫下该指标的测定值，计算各品种每个生长指标的耐盐系数。将生长指标测定值和耐盐系数均按U（X）= （X-a1）/（a2-a1）转换为隶属函数值，其中，X指某生长指标的测定值或其耐盐系数;a1= min（X），指某一群体该指标的最小值;a2= max（X），指某一群体该指标的最大值。基于隶属函数值，采用欧式距离法对29份种质进行聚类分析，综合评价其耐盐性。
　　1.2.2 高度耐盐种质的筛选 经过上述耐盐性评价，筛选出耐盐性较强的种质，进行更高浓度的NaCl胁迫试验，以筛选高度耐盐的马铃薯种质。 　　将筛选出的种质组培苗茎段分别接种到含有1.00%和1.25% NaCl的MS培养基上，培养条件同上，20 d后测定株高、单株根数和叶片叶绿素含量。
　　1.3 数据处理与分析
　　数据采用Microsoft Excel 2007和DPS 7.05进行处理，并采用欧氏距离法进行系统聚类分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 马铃薯种质的耐盐性评价
　　根据组培苗的生长性状及耐盐系数对29份马铃薯种质的耐盐性进行评价。
　　2.1.1 基于耐盐系数的马铃薯种质耐盐性评价 由表2可见，在0.75% NaCl胁迫下，除SD411和SD400的单株鲜重外，马铃薯种质的株高、单株根数、单株鲜重和叶片叶绿素含量均降低，其中SD636、内薯7号、双丰5号、13vC3-19、SD602、16vP83的组培苗生长被完全抑制。在测定的4个指标中，株高受NaCl胁迫的影响最大，耐盐系数都小于0.60;单株鲜重受影响较小，耐盐系数大于或等于0.60的种质有12份。
　　对株高、单株根数、单株鲜重和叶片叶绿素含量四个指标的耐盐系数进行隶属函数转换，并进行聚类分析。结果（表2）显示，SD751叶绿素含量、株高、单株根数的耐盐系数的隶属函数值最高，均为1.00;单株鲜重的隶属函数值为0.74。SD400植株鲜重的隶属函数值为1.00，株高、单株根数的隶属函数值也较高，分别为0.95和0.96;叶绿素含量的隶属函数值稍低，为0.42。系统聚类分析结果（图1）显示，在欧氏距离0.38处，可将29份马铃薯种质聚为三大类，SD751为第一类，SD400为第二类，其余27份种质聚为一类。综合来看，SD751的耐盐性最强，其次为SD400。
　　2.1.2 NaCl胁迫下马铃薯组培苗的生长状况
　　不同马铃薯种质在盐胁迫下，株高、单株根数、单株鲜重和叶片叶绿素含量方面差异明显（表3）。叶绿素含量在20以上的种质有5份，株高在2 cm以上的种质有7份，单株根数在2条及以上的种质有8份;单株鲜重在0.20 g以上的仅3份。其中，SD751和SD400的叶绿素含量、单株鲜重、株高、单株根数分别为39.12和16.15、0.14 g和0.41 g、3.94 cm和4.07 cm、3.27条和4.80条。
　　将29份种质的株高、单株根数、单株鲜重和叶片叶绿素含量测量值转换为隶属函数值并进行聚类分析。结果（表3）显示，SD400的单株鲜重、株高、单株根数的隶属函数值均为1.00;SD405的單株鲜重及SD751的叶片叶绿素含量的隶属函数值均为1.00。聚类分析结果（图2）显示，在欧氏距离0.34处，29份种质可聚为5类，SD400、SD751、SD741均单独聚为一类，SD411和SD405聚为一类，其余种质聚为一类。综合来看，在0.75%NaCl胁迫下，SD400组培苗生长良好，其次为SD405、SD411、SD751、SD741。
　　2.2 高度耐盐种质的进一步鉴定
　　通过上述耐盐性评价，筛选出两个耐盐性强的种质SD751和SD400。为了明确这2份种质的耐盐极限，加大选择压，设置1.00%和1.25%的NaCl处理，分析其在高浓度NaCl胁迫下的生长情况和耐盐系数。
　　结果（表4）显示，在1.00% NaCl胁迫下，SD400和SD751生长受到明显抑制，叶绿素含量分别为对照的27.52%和53.59%，株高分别为对照的21.92%和29.05%，单株根数分别为对照的26.61%和45.07%。当NaCl浓度提高至1.25%时，仅SD751还有微量生长，SD400已经停止生长。说明SD751和SD400对1.00% NaCl具有一定的耐性，且SD751的耐盐性更强，在1.25% NaCl胁迫下仍有一定的生长量。
　　3 讨论与结论
　　我国的盐碱地类型主要分为东部滨海盐土及滩涂、黄淮海平原盐渍土、东北松嫩平原盐土和碱土、半漠境内陆盐土和青新极端干旱的漠境盐土[4]。其中滨海盐碱地土壤中阳离子以Na+含量最高，约占70%以上;其次为Mg2+，再次为K+，Ca2+含量最低;土壤中的阴离子以Cl-含量最高，其次为SO42-，再次为HCO3-，CO32-含量最低，Cl-含量占阴离子总量的72.4%[7]。黄淮海平原盐碱地阳离子主要有Na+、Ca2+、Mg2+，阴离子主要有Cl-、HCO3-、SO42-，Na+占阳离子总量在85%以上，Cl-占阴离子总量的80%以上[8]，可见，盐碱土的主要阳离子和阴离子分别为Na+和Cl-。因此本研究在筛选耐盐种质资源时采用NaCl胁迫处理。本课题组前期的研究表明，在0.75% NaCl胁迫时，不同品系的生长状况差异最大，因此，0.75%NaCl可作为筛选马铃薯耐盐品系的适宜浓度[3]。
　　盐胁迫下马铃薯的株高、新叶数、根数、根长等形态指标表现出不同程度的下降，叶绿素、丙二醛、脯氨酸含量等生理指标也呈现明显变化[9， 10]。目前马铃薯耐盐性筛选指标并没有统一的标准。但有研究表明，马铃薯植株的叶绿素含量对盐胁迫反应极为敏感，可以作为指示马铃薯盐逆境反应的指标[11];盐胁迫下马铃薯株高受到的影响最大，短时间内就产生可见的胁迫效果，并且不同品种间差异最大，可以作为耐盐品种筛选的指标[12， 13];盐敏感品种的茎、根长度和干鲜重也显示出比耐受品种更大的降低，也可以作为耐盐品种筛选的指标[14];叶片的电导率、丙二醛含量、可溶性糖含量和脯氨酸含量与耐盐性有很好的相关性，可用来鉴定马铃薯的耐盐性[10， 15];随盐浓度升高，马铃薯耐盐组与敏感组SOD 和POD活性的变化趋势存在显著差异[16]。可见，上述指标都可用于马铃薯耐盐品种的筛选。最终，本试验选取叶片叶绿素含量、株高、单株根数、单株鲜重作为马铃薯种质耐盐性评价的指标。 　　植物的耐盐性评价可根据植物在盐胁迫下的耐盐系数[12，17，18]和生长情况[19]来进行。本研究结合耐盐系数和组培苗的生长性状如叶片叶绿素含量、株高、单株根数、单株鲜重对29份马铃薯种质进行耐盐性评价，筛选出受盐胁迫影响较小、生长较好的种质。另外，本研究采用隶属函数法将各指标的耐盐系数和测定值都转换为[0，1]的度量值，增强了不同指标间的可比性，同时采用系统聚类分析方法对品种的耐盐性分级，通过综合表现更好地评价每个种质。经综合评价，筛选出两个高度耐盐种质SD400和SD751。两者在0.75% NaCl处理下生长较好，受盐胁迫影响较小;在1.00% NaCl处理下，仍有一定量生长，叶绿素含量分别为对照的27.52%和53.59%，株高分别为对照的21.92%和29.05%，单株根数分别为对照的26.61%和45.07%;但在高盐（1.25% NaCl）胁迫下，仅SD751还有微量生长。综合来看，SD751和SD400都具有较好的NaCl耐性，且SD751的耐盐性更高。
　　在NaCl胁迫下，根系吸收大量Na+与Cl-后，先以渗透胁迫的形式抑制植物生长，然后造成离子毒害，引起细胞膜破裂、离子稳态失衡、细胞器受损和代谢失调[20， 21]。为应对这种伤害，植物主要采取泌盐、稀盐、拒盐、聚盐等耐盐途径[22， 23]。本研究筛选出的高度耐盐种质在1.00% NaCl胁迫下叶片叶绿素含量下降幅度相比盐敏感品种降幅要小，说明高度耐盐种质叶片中的叶绿体受到Na+毒害相对较小。由于Na+在细胞质中积累的越少，在液泡中积累的越多，Na+毒性越低[24]，因此耐盐种质叶片中的Na+毒性低，可能与Na+被区隔化在液泡中有关，即耐盐种质采用拒盐的途径降低盐胁迫造成的伤害。另外，耐盐种质根数较多，可能采用稀盐途径通过吸收更多的水分来稀释体内盐分，降低盐离子的毒害。
　　本研究利用隶属函数法和系统聚类法综合筛选出两个高度耐盐种质SD751和SD400，可为马铃薯种质创新及耐盐品种选育提供良好的材料和方法参考。
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