黄豆幼苗生长过程中第一真叶与第二真叶生理指标的比较

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　　摘要：以黄豆[Giycine max （Linn.） Merrill]幼苗的第一真叶和第二真叶为研究对象，测定了第一真叶和第二真叶的可溶性蛋白质、光合色素、丙二醛和抗坏血酸含量以及过氧化氢酶和过氧化物酶活性。结果表明，第一真叶与第二真叶中的可溶性蛋白质含量没有显著性差异;第二真叶中的叶绿素a和类胡萝卜素含量高于第一真叶，分别高23.4%和89.9%，第一真叶中的叶绿素b含量高于第二真叶，高76.9%，总光合色素含量在第一真叶与第二真叶中较为接近，第二真叶中叶绿素a/b的值是第一真叶中的2.18倍;第一真叶的丙二醛含量高于第二真叶，前者是后者的3.04倍;第二真叶的抗坏血酸含量高于第一真叶，是后者的1.52倍;两真叶中未测到过氧化物酶和过氧化氢酶活性。抗坏血酸含量与可溶性蛋白质含量、丙二醛含量和叶绿素b含量为负相关，与叶绿素a含量和类胡萝卜素含量为正相关。
　　关键词：黄豆[Giycine max （Linn.） Merrill];幼苗;第一真叶;第二真叶;生理指标
　　中图分类号：S529         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）05-0021-04
　　Abstract： Soluble protein content， photosynthetic pigment content， MDA content， ascorbic acid content， enzyme activity and peroxidase activity of hydrogen peroxide in the first leaf and the second leaf of soybean [Giycine max （Linn.） Merrill] seedlings were determined. The results showed that there was no significant difference in soluble protein content between the first and second true leaf. The content of chlorophyll a and carotenoid in the second leaf was 23.4% and 89.9% higher than those in the first leaf， respectively. The content of chlorophyll b in the first leaf was 76.9% higher than that in the second leaf. The total photosynthetic pigment content in first leaf and second leaf were close to each other. The value of chlorophyll a/b in the second leaf was about 2.18 times higher than that in the first true leaf. The MDA content in the first true leaf was 3.04 times higher than that in the second true leaf. The content of ascorbic acid in the second leaf was 1.52 times higher than that in the first true leaf. The peroxidase activity and catalase activity could not been determined in these two leaves. Besides that， ascorbic acid content was negatively correlated with the content soluble protein， MDA and chlorophyll b， and was positively correlated with the content of chlorophyll a and carotenoid.
　　Key words： soybean[Giycine max （Linn.） Merrill]; seedling; the first leaf; the second leaf; physiological index
　　真叶是维管植物最为重要的器官之一。真叶叶片作为植物主要的光合器官，是植物生长过程中能量和物质的最主要来源，其生理状态和形态对植物的光合作用、蒸腾作用与抗逆性等生理功能以及植物的生长发育都有很大的影响。如小麦的旗叶和水稻的剑叶都对其本身的产量有较大影响。因此研究黄豆[Giycine max （Linn.） Merrill]幼苗真叶叶片的指标，判断其生理学功能和生理状态对黄豆也具有重要的生产和实践意义。本试验选择黄豆幼苗生长过程中的第一真叶和第二真叶为研究对象，测定了第一真叶和第二真叶中的抗坏血酸（Ascorbic acid，AsA）、可溶性蛋白质、光合色素、丙二醛含量以及过氧化物酶和过氧化氢酶活性等生理指标。
　　拟南芥AsA突变体植株中，AsA含量的降低导致拟南芥细胞的分裂和生长受到了抑制，从而使得拟南芥嫩枝生长速率降低[1]。还有研究发现，紫黄质脱环氧酶和一些次生代谢物所需的代谢酶类都需要AsA作為辅因子[2]，参与细胞内的生物化学反应，调节细胞的生长状态。此外，AsA在植物中具有清除自由基和抗氧化的生理功能，在植物的光保护和光合作用、细胞生长和分裂等诸多生理过程中也有着非常重要的生理调节功能[3-5]。此外，在清除植物体内因环境胁迫、光合作用和氧代谢等产生的活性氧的过程中，AsA可以起到直接的降低作用[6]。植物PS Ⅰ中氧的光还原过程会产生H2O2，其必须通过AsA过氧化酶清除。AsA同样也是PS Ⅱ的电子供体[6，7]。因此，植物细胞内AsA含量的增加往往能增强植物抵抗逆境的能力而延缓衰老。鉴于以上原因，在测定抗坏血酸、可溶性蛋白质、光合色素、丙二醛及过氧化物酶和过氧化氢酶活性后，对抗坏血酸含量与其他生理指标的相关性也初步进行了分析。 　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  试验材料  选择大小均一的黄豆种子在装有河沙的种植盆（长30 cm，宽30 cm，深10 cm;其中河沙深度8 cm，河沙经去离子水清洗）中，6行6列（30颗/盆），塑料薄膜覆盖，种植盆置于光照培养箱内，条件为白天28 ℃/12 h，夜间20 ℃/12 h，光照度为800 μmol/（m2·s），相对湿度75%，出苗后开始每隔1 d向种植盆内均匀喷洒Hoagland营养液200 mL。待幼苗长至第三真叶时，选择长势整齐植株的第一真叶和第二真叶进行测定。第一真叶和第二真叶样本数不少于30。
　　1.1.2  试验试剂  牛血清标准蛋白、考马斯亮蓝G250、85%偏磷酸、浓盐酸、2，6-二氯酚靛酚、抗坏血酸、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、氢氧化钠、石英砂、碳酸钙、愈创木酚、Na2HPO4、KH2PO4、H2O2、96%乙醇，均为分析纯，试验用水为去离子水。
　　1.1.3  试验仪器  T6新悦分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;HZT-B3000电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器上海有限公司）;台式高速离心机（Sigma）;pH试纸;UVmini1240紫外分光光度计（岛津）;水浴锅;电炉（天津泰斯特仪器有限公司）;药品低温冰箱（海尔）等。
　　1.2  方法
　　1.2.1  黄豆叶片的预处理  选取黄豆幼苗第一真叶和第二真叶，用去离子水清洗新鲜叶片表面后，用吸水纸吸干表面水分，在电子天平上进行称量，并记录质量。
　　1.2.2  生理指标含量的测定  叶片中可溶性蛋白质含量、光合色素含量、丙二醛含量和过氧化氢酶活性的测定和计算参考文献[8]进行;过氧化物酶活性的测定和计算参考文献[9]进行;抗坏血酸含量的测定和计算参考文献[10]。
　　1.2.3  数据分析  数据分析采用SPSS 13.0软件进行，显著性检验采用配对t检验，相关分析采用两因素相关分析中的Spearman相关。
　　2  结果与分析
　　2.1  各生理生化指标表现
　　2.1.1  光合色素含量  将试验中测定的665、649、470 nm处的吸光度按公式进行计算，得出第一真叶和第二真叶中的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量，并计算总光合色素含量和叶绿素a/b，结果见图1。由图1可知，第二真叶中的叶绿素a和类胡萝卜素含量高于第一真叶，分别高23.4%和89.9%;第一真叶中的叶绿素b含量高于第二真叶，高76.9%;总光合色素含量在第一真叶和第二真叶中较为接近。第二真叶中叶绿素a/b是第一真叶中的2.18倍。
　　对第一真叶和第二真叶中的光合色素含量值进行独立样本t检验，叶绿素a的双尾显著性检验P为0.002，說明在黄豆幼苗生长发育过程中，第一真叶和第二真叶中叶绿素a含量有极显著性差异;叶绿素b和类胡萝卜素的双尾显著性检验P均为0.000，说明在黄豆幼苗生长发育过程中，第一真叶和第二真叶中叶绿素b含量和类胡萝卜素含量均有极显著性差异;对叶绿素a/b进行独立样本t检验，双尾显著性检验P均为0.000，说明在黄豆幼苗生长发育过程中，叶绿素a/b有极显著性差异。
　　2.1.2  可溶性蛋白质含量  由表1可知，黄豆幼苗生长发育过程中，第一真叶的可溶性蛋白质含量略高于第二真叶。对第一真叶和第二真叶中的可溶性蛋白质含量值进行独立样本t检验，双尾显著性检验P为0.478，说明在黄豆幼苗生长发育过程中，第一真叶和第二真叶中可溶性蛋白质含量没有显著性差异。
　　2.1.3  丙二醛含量  由表1可知，黄豆幼苗生长发育过程中，第一真叶的丙二醛含量高于第二真叶，前者是后者的3.04倍。对第一真叶和第二真叶中的丙二醛含量进行独立样本t检验，双尾显著性检验P为0.000，说明在黄豆幼苗生长发育过程中，第一真叶和第二真叶中丙二醛含量有极显著性差异。
　　2.1.4  抗坏血酸含量  由表1可知，黄豆幼苗生长发育过程中，第二真叶的抗坏血酸含量高于第一真叶，是后者的1.52倍。对第一真叶和第二真叶中的抗坏血酸含量进行独立样本t检验，双尾显著性检验P为0.002，说明在黄豆幼苗生长发育过程中，第一真叶与第二真叶中抗坏血酸含量有极显著性差异。
　　2.1.5  过氧化物酶和过氧化氢酶活性  利用分光光度法分别测定了第一真叶和第二真叶的过氧化物酶和过氧化氢酶活性，但测定结果显示，过氧化物酶和过氧化氢酶基本无活性。
　　2.2  抗坏血酸含量与其他各指标间的相关性分析
　　2.2.1  抗坏血酸含量与可溶性蛋白质含量的相关关系  对测定的第一真叶和第二真叶中的抗坏血酸含量与可溶性蛋白质含量进行Spearman相关分析，相关系数为-0.177，表明抗坏血酸含量与可溶性蛋白质含量为负相关;P为0.738，相关不显著（表2）。
　　2.2.2  抗坏血酸含量与光合色素含量的相关关系  由表2可知，在黄豆幼苗生长过程的第一真叶期和第二真叶期中，抗坏血酸含量与叶绿素a、类胡萝卜素含量为正相关，与叶绿素b含量为负相关，所有相关检验的P均未达到显著性水平。
　　2.2.3  抗坏血酸含量与丙二醛含量的相关关系  对测定的第一真叶和第二真叶中的抗坏血酸含量与丙二醛含量进行Spearman相关分析，相关系数为-0.618，抗坏血酸含量与丙二醛含量为负相关;P为0.191，相关不显著（表2）。 　　3  小結与讨论
　　3.1  讨论
　　植物体内的可溶性蛋白质是植物组织的保护物质，可降低组织或者细胞的冰点，使细胞的水合度增大，保水能力增强，避免原生质在低温下受到伤害[11]。可溶性蛋白质也是植物的渗透调节剂之一，蛋白质含量增加，降低细胞的渗透势[12，13]。作为一种在植物体内具有调节和保护功能的物质，目前可溶性蛋白质的研究更多地是集中于植物在寒冷、盐胁迫等逆境中其含量的变化上[11-16]，较少关注植物生长发育过程中不同阶段的含量变化。黄豆幼苗生长发育过程中，对可溶性蛋白质的试验测定结果表明，第一真叶与第二真叶中的可溶性蛋白质含量接近，说明在黄豆幼苗生长发育的早期，不同生长时间的真叶叶片中可溶性蛋白质含量变化不大。
　　植物光合作用的基础是光合色素，各种光合色素含量的不同会影响植物的光合作用速率[17]。本试验结果表明，在黄豆幼苗的功能叶片中，第二真叶的叶绿素a含量高于第一真叶，该结果与花生幼苗生长发育过程中功能叶片的结果是一致的[18]。阳生植物中，叶绿素a与叶绿素b的比值大于阴生植物，该比值可以反映植物对光能的利用程度[19]。本试验结果显示，第二真叶中的叶绿素a/b大于第一真叶，说明第二真叶对光能的利用率要高于第一真叶。
　　作为膜脂过氧化的产物，丙二醛含量的高低可以反映细胞质膜过氧化的程度[20]。植物在生长过程中，生成的丙二醛含量可以使叶绿素和蛋白质降解，进而使植物的叶片凋亡和脱落[21，22]。第二真叶中的丙二醛含量远低于第一真叶，说明第二真叶的膜脂过氧化程度远低于第一真叶。结合叶片中可溶性蛋白质和叶绿素含量的结果，丙二醛对可溶性蛋白的降解影响更小，而对光合色素的作用可能会更大。具体而言，丙二醛可能对叶绿素a的降解作用更为显著。
　　另外，抗坏血酸在清除自身的活性氧和抗氧化方面具有重要的生理功能，类胡萝卜素也是植物体内重要的抗氧化剂[20]。第二真叶中较高的抗坏血酸和类胡萝卜素含量可能在植物生长的早期维持了植物体内较低的过氧化物水平，作为植物体内的第一道防线在赋予植物的抗氧化能力上具有重要作用。其内在关系可能是，高抗坏血酸和高类胡萝卜素含量降低了植物体内的O2-·，进而降低了植物膜脂的过氧化水平，降低了丙二醛含量。当此作用可以维持植物体内较低的丙二醛含量水平时，植物可以避免合成相关的过氧化物酶类，从而维持植物体内物质和能量流动的最佳方向。这也可能是本试验中没有测定出过氧化物酶活性的内在原因。
　　3.2  小结
　　通过对黄豆幼苗生长发育早期中第一真叶和第二真叶的部分生理数据进行比较可知，第一真叶中较高的丙二醛含量与较低的叶绿素a含量和较高的叶绿素b含量对应，第二真叶中较低的丙二醛含量与较高的叶绿素a含量和较低的叶绿素b含量对应，判断丙二醛对叶绿素a具有较大的破坏作用，对叶绿素b则不具有破坏性，说明MDA对光合色素的破坏具有选择性;抗坏血酸含量与可溶性蛋白质、叶绿素b和丙二醛含量呈负相关，与叶绿素a和类胡萝卜素含量呈正相关，但相关均不显著。
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