第三方检验检测机构PCR检测室防核酸污染措施

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　　【摘 要】随着社会的需求，第三方检验检测机构的数量日益增多。检测数据的准确性不仅关乎检测机构的检测水平，也直接影响行政机关的执法效力，因此检测实验室必须确保其检测数据科学公正、准确可靠。核酸检测是第三方检验检测机构中最常见的检测项目，而气溶胶污染是核酸检测中最主要最常见的污染，也是困扰绝大多数实验室的难题，必须要加以重视。本文就本中心在核酸检测防污染方面的体会进行初步总结。
　　【关键词】检验检测机构;PCR检测室;核酸检测;气溶胶污染
　　中图分类号： E9393 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）28-0049-002
　　DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.28.018
　　【Abstract】The number of the third party inspection and testing institutions is increasing with the demands of the society.The accuracy of the testing results not only relates to the testing level of the institution，but also directly affects the enforcement effectiveness of administrative agencies.The testing results must be scientific，fair，accurate and reliable in the third party inspection and testing institutions.Nucleic acid testing is the most common project，and the aerosol pollution is the most common pollution in nucleic acid testing， and it is also a problem existed in most laboratories，so we must take it seriously.The experience of preventing the nucleic acid pollution is preliminary summarized in this paper.
　　【Key words】Inspection and testing institutions;PCR testing rooms;Nucleic acid testing;Aerosol pollution
　　隨着养殖企业的增多，部分养殖企业管理不规范，饲养环境恶劣，存在抗生素的滥用和疫苗的不合理使用现象，使得病毒也在不断地演化，导致养殖业面临更高的疾病暴发率，疾病的病因也越来越复杂，往往存在多种病原感染。第三方检验检测机构一般均会设立PCR检测室，直接针对病原核酸进行检测，核酸检测特异性强、灵敏度高，对疾病的诊断起着至关重要的作用，但在操作过程中易受到污染，导致假阳性的结果[1]，其中最常见且最难消除的污染为气溶胶污染。气溶胶污染一般是在提取阳性样品的核酸或PCR时使用移液器加样时产生，一个气溶胶粒子能携带上万个DNA分子，这些DNA分子漂浮在空气中，难以消除，部分可附着在检测人员的衣物上，随着人或物的流通而进一步污染整个实验室，对实验结果产生严重的干扰，因此解决和监控气溶胶污染是第三方检验检测机构确保检测结果质量的必由之路。本中心作为江苏省内动检领域首家通过CMA认证的高校检测机构，在解决和监控核酸污染方面积累了一定的经验，现总结如下。
　　1 PCR检测室布局需合理
　　PCR整个试验分试剂准备区（一区）、核酸提取区（二区）、扩增区（三区）和产物分析区（四区），流转顺序为试剂准备区→核酸提取区→扩增区→产物分析区，试剂、样本等在各区之间以相应传递窗单向传递，严禁人员、器材和试剂倒流。各区均设有缓冲间，工作服和清洁消毒物品不得跨区混用。各区在空间上完全独立，不能相通，各区均有独立的通风系统，四个区域的压力依次递减，一区、二区保持正压，三区、四区保持负压状态，各区之间压差≥5Pa。PCR检测室的进风口和出风口不能设在建筑的同一平面，以避免排出的空气被重新吸进实验室[2]。
　　2 加强实验室的质量控制措施
　　2.1 强化生物安全意识
　　试剂准备区（配液区）要求高度洁净，定期监控，不能存在病原核酸污染;核酸提取区要有相应的生物安全设施，病料的处理需在生物安全柜内进行;产物分析区使用溴化乙锭的区域要与其他操作区域相互隔离。实验人员应做好防护措施，实验过程中必须穿戴相应区域的工作服、口罩，戴一次性无粉手套，疑有污染应立即更换。未检测的样品和检毕样品应分开存放在冰箱指定位置，检毕样品超过留样时间须经高压灭菌处理后再送废弃物处理中心处置。
　　2.2 加强人员管理和培训
　　实验室应建立人员管理和培训制度。检测人员必须进行岗前培训（包括实验技能培训和生物安全培训）并经考核合格后方可进行检测工作，检测过程全程严格按照实验室标准操作规程（SOP）进行操作。移液器使用时动作要轻柔并全程在生物安全柜中进行，阴性对照加液全部在配液区完成并优先盖好管盖，阳性对照和样本除核酸外其余均在配液区加液盖好管盖，然后至核酸提取区加入样本核酸并轻轻盖好管盖，最后加入阳性核酸对照盖好管盖，将所有PCR管瞬离后进行核酸扩增。扩增结束后先离心，将管帽和管壁上的液体离至管底，防止开盖时液体溅出污染实验室，再在PCR产物分析区进行电泳。实验结束后按照SOP要求对实验室进行清洁消毒，清洁时不同区域的抹布禁止混用，石浩宇等[3]通过荧光定量PCR方法对实验室环境监测发现不同区域的抹布混用可引起核酸污染，消毒采用紫外消毒和75%酒精擦拭、喷雾消毒相结合。实验室应定期对人员进行理论知识、实际操作和生物安全方面的培训，安排人员定期对实验室进行消毒和环境监测，发现污染及时上报处理。 　　2.3 按规定存放试剂和耗材
　　核酸检测涉及试剂种类较多，必须按实验室和试剂存储要求存放于指定位置，禁止乱拿乱放。PCR反应涉及的试剂按说明书要求存放于配液区冰箱中，配液区为整个PCR检测室最为洁净的区域，严禁任何核酸溶液（包括样本核酸和阳性对照）进入该区域。DNA或RNA提取试剂盒在核酸提取区打开使用后只能在该区域存放，严禁流入其他区域。高压过后的洁净耗材保存在试剂准备区，并单向流转到其他区域，最后通过污物走廊高压灭菌处理后再送废弃物处理中心，严禁试剂和耗材的倒流。
　　3 加强实验室的消毒措施
　　3.1 化学消毒
　　PCR检测室可交替使用75%酒精或6%双氧水进行封闭消毒，每周至少消毒一次。先用装有75%酒精的气溶胶消毒机对实验室空气进行密集喷淋，以对实验过程中产生的气溶胶具有较好的沉降效果，然后再用84消毒液擦拭实验台面或拖擦地面，作用10min后用清水擦拭实验台面，以防84消毒液残留抑制实验结果，仪器设备表面及实验辅助用品如指形管架等也应使用75%乙醇定期擦拭消毒。PCR检测室还可直接使用装有6%双氧水的气溶胶消毒机对实验室空气进行喷雾消毒，工作20min后继续关闭门窗熏蒸半小时至一小时，然后打开实验室通风设备进行换气。
　　另外，也可使用商品化的气溶胶污染清除剂进行消毒，某些核酸气溶胶污染清除剂可有效降解95%以上的DNA气溶胶污染和99%以上的RNA气溶胶污染，可用于清洁设备、耗材、操作台及环境中的核酸污染。
　　3.2 物理消毒
　　紫外消毒是一种高效、安全、环保、经济的技术，能够有效地杀灭病毒、细菌和原生动物，而且几乎不产生任何消毒副产物，无二次污染，且不受水体温度、pH值的影响。因此，PCR检测室各区域应配备紫外灯，实验结束后打开实验室各区域的紫外灯进行紫外消毒，照射时间≥1h[4]。紫外灯管累计工作1000h或辐射强度低于70μW/cm2时应及时更换灯管。生物安全柜在实验开始前半小时和结束后半小时也应进行紫外消毒。
　　4 定期对实验室进行监控
　　4.1 實验室温度、湿度控制
　　气溶胶浓度在相对条件下与温度成负相关，与湿度成正相关[5]，PCR检测室应合理控制实验室温度、湿度于规定要求范围内，尽量减少温湿度的波动，以减少气溶胶的产生。
　　4.2 定期对实验室进行环境监控
　　每个月监控实验室是否存在污染，清洁消毒效果是否良好。采集环境中的样本进行核酸污染监控，可用擦拭法对PCR检测室的仪器设备、实验台面、地面、传递窗等部位进行相关核酸的检测，任一部位环境监测结果不合格，均应采取相应措施加强实验室清洁消毒，直至环境监测结果全部合格。安排检测员记录阳性率及假阳性的发生频率，及时发现异常，若检测过程中发现阳性率异常升高、阴性对照频繁出现假阳性、未知扩增条带重复出现等问题，极有可能发生了核酸气溶胶污染，应紧急进行污染源的排除和清理。
　　本中心作为由高校成立的非独立法人第三方检验检测机构，为社会提供优质的检测服务和公证的数据以及出具具有法律效力的检测报告是本中心工作的重点，中心检测水平的高低更是关乎高校的声誉，PCR检测作为日常检测的重点项目更是应该保证其检测结果的准确性，因此检测过程中必须严格执行标准操作规程，加强防止交叉污染的意识，做好实验室的清洁消毒和环境监测工作，避免因核酸污染而造成假阳性结果。
　　【参考文献】
　　[1]Kwok S，Higuchi R.Avoiding false positives with PCR[J]. Nature，1989，339（6221）：237.
　　[2]薛秀荣，来祝檩，韩惠云.浅谈核酸检测实验室防污染措施[J].中国卫生产业，2018，15（26）：144-145.
　　[3]石浩宇，刘毅，范鹏程.PCR实验室核酸污染监测及排除[J].中国医疗器械信息，2018，24（07）：25-26，36.
　　[4]郭灵安，雷绍荣，宋君.紫外线清除实验室转基因物质污染的效果研究[J].中国消毒学杂志，2015，32（5）：437-439.
　　[5]倪沈阳，石巍，陈琬玥，等.温湿度对气溶胶浓度影响的模拟研究[J].吉林建筑大学学报，2016，33（6）：53-56.
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