猪流行性腹泻病毒ＨＢ２０１６０２株的分离鉴定及Ｓ１基因序列分析

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　　摘要：从湖北地区规模化养殖场疑似腹泻病料中成功检测并分离获得了一株猪流行性腹泻病毒，分离毒株感染Vero细胞可引起明显的细胞病变，病毒效价达1.0×105.6 TCID50/0.1 mL。间接免疫荧光结果显示HB201602感染细胞后，能被抗PEDV S蛋白的特异性单克隆抗体所识别，进一步证实所分离毒株为PEDV病毒。基于S1基因构建了系统发育树，表明2011年后分离的毒株大多以G2型变异毒株为主，HB201602属于G2-a亚型（变异毒株）簇。S1基因遗传变异分析发现G1-b亚型毒株与其他簇毒株相比存在9个特异的氨基酸突变，G1-a亚型经典毒株存在4个特异的氨基酸突变，S1基因的变异分析将有助于了解PEDV的遗传变异趋势，为新型疫苗的研发提供依据。
　　关键词：猪流行性腹泻;分离鉴定;序列分析;系统发育树;遗傳变异
　　中图分类号：S852.65+1         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）24-0227-05
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.055           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Isolation and identification of HB201602 strain of porcine epidemic
　　diarrhea virus and phylogenetic tree analyses based on S1 gene
　　LIU Wei，YUAN Fang-yan，ZHOU Dan-na，LIU Ze-wen，YANG Ke-li，DUAN Zheng-ying，
　　GUO Rui，GAO Ting，LIANG Wan，TIAN Yong-xiang
　　（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Science-observation Experiment Station of Veterinary Medicine and Diagnostic Technology （Ministry of Agriculture and Rural Affairs），Wuhan 430064，China）
　　Abstract： Porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） HB201602 strain was isolated from the piglets suspected to be suffering a severe diarrhea in Hubei Province. The isolated strain can infect Vero cells and cause obvious cell pathological change， with viral titer up to 1.0×105.6 TCID50/0.1ml. Indirect immunofluorescence results indicated that HB201602 infected cells could be recognized by monoclonal antibodies against PEDV S protein， further confirming that the isolated strain was PEDV virus. Phylogenetic trees were constructed based on S1 gene， and the results indicated that most of the strains isolated after 2011 were G2 variant strains， and HB201602 belonged to G2-a subtype （variant strain） cluster. Genetic variation analysis of S1 gene shows that G1-b subtype strain has 9 specific single amino acid mutations compared with other cluster strains， and G1-a subtype classical strain has 4 specific amino acid mutations. Variation analysis of S1 gene will provide a basis for understanding the genetic variation trend of PEDV and the development of new vaccines.
　　Key words： porcine epidemic diarrhea virus; isolation; sequence analysis; phylogenetic tree; genetic variation
　　猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种高度接触性肠道传染病[1]，各年龄和品种的猪均易感，成年猪感染后临床症状表现轻微，但对哺乳仔猪危害最为严重，感染仔猪临床表现为腹泻、呕吐、脱水甚至死亡，发病率高达100%，死亡率为30%～80%[2]。 　　1971年，该病在英国首次报道，随后在英国、德国、比利时、西班牙等地呈现流行态势。近年来，PED在北美洲和亚洲出现暴发，对养猪业造成了巨大的经济损失。2013年，美国暴发PED疫情，随后迅速传播至其他州以及毗邻的加拿大和墨西哥。1976年，中国首次报道了PED的流行，近年来，流行性腹泻疫情呈上升趋势[3-5]。猪流行性腹泻平均每年造成了美国和中国超过8百万头仔猪的死亡，给养猪业带来了巨大的经济损失[6-8]。
　　PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属的α冠状病毒，是一种单股正链不分节段的RNA病毒。PEDV基因组大小约为28 kb，5’端有一个帽子结构（cap），3’端有一个poly（A）尾，由7个ORFs组成，主要的结构蛋白为纤突糖蛋白（S）、小囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）[9，10]。S蛋白由S1（1-735 aa）和S2（736-1356 aa）两部分组成，S1主要介导病毒与宿主细胞受体的结合，S2可通过诱导构象改变促使病毒进入宿主细胞[11，12]。研究表明，PEDV S基因突变更能表现PEDV的变异情况，不同地区不同时间分离毒株的核酸差异主要集中在S基因，因此PEDV S基因常用于研究不同毒株之间的亲缘关系、遗传变异、流行特征以及毒力预测等[13，14]。
　　本研究从湖北省自发仔猪腹泻疫病的猪群中采集粪便样品，进行了病毒的分离培养、通过RT-PCR核酸片段检测以及间接免疫荧光（IFA）试验，证实所分离毒株为PEDV，同时测定了病毒的TCID50，并对其S1基因进行了序列测定以及遗传进化分析，为下一步生物学特性及疫苗开发等研究奠定了基础。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  病料来源  猪流行性腹泻典型临床病例采集自湖北省不同地区猪场，采样猪场中出现仔猪严重腹泻、呕吐、脱水以及死亡等疑似病例，采集样品为发病猪的粪便或小肠内容物等。
　　1.1.2  工具酶及主要试剂  各种限制性内切酶（Restriction endonuclease，RE）、高保真酶PrimerSTARTM、dNTPs、逆转录试剂盒、DNA Marker等工具酶购自宝生物工程（大连）有限公司;双抗（青霉素-链霉素）溶液、RPMI-1640培养基、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培养基购自美国GIBCOTM公司;DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司;胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司;Vero传代细胞系和抗PEDV S蛋白单克隆抗体（MAb）由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医实验室保存。
　　1.2  方法
　　1.2.1  病毒的分离与培养  粪便样品经PBS重悬离心后取上清液，提取上清液中RNA，利用逆转录试剂盒制备cDNA，并使用PEDV检测引物（表1）对获得的cDNA进行检测。检测为阳性的上清液样品通过0.45 μm滤器除菌后，接种于Vero传代细胞系，于37 ℃的CO2培养箱（5%）中恒温恒湿培养，每天观察细胞病变（CPE）。收获细胞病变明显样品，反复冻融3次后，继续接种Vero传代细胞系，连续体外传代培养。
　　1.2.2  病毒的间接免疫荧光（IFA）鉴定  将HB201602
　　分离病毒株感染Vero单层细胞，感染24 h后弃掉维持液，使用4 ℃预冷的90%乙醇固定20 min（维持4 ℃低温），弃去固定液，自然干燥，PBS洗涤3次，每次5 min，自然干燥。以抗PEDV S蛋白MAb（1∶1 000）作为1抗，以抗鼠IgG-FITC（1∶2 000）作为二抗，在荧光倒置显微镜下观察检测结果，对分离毒株进行IFA鉴定。
　　1.2.3  S1基因测序及进化分析  以HB201602分离毒株RNA为模板，逆转录试剂盒制备cDNA，设计引物扩增PEDV S1基因（表1）。将RT-PCR扩增得到的DNA产物利用胶回收试剂盒进行纯化，产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列的测定。在NCBI GenBank中下载国内外PEDV代表性毒株的S1基因序列，采用MEGA软件对包括HB201602分离毒株在内的23株PEDV S1基因进行进化分析。
　　2  结果与分析
　　2.1  临床样品RT-PCR检测
　　将采集的8份临床疑似样品经处理后通过RT-PCR方法对其进行检测。结果表明，8份临床样品均扩增出大小约为660 bp的目的片段，与预期目的条带大小一致（图1）。
　　2.2  病毒的分离与效价测定
　　RT-PCR检测确定的阳性临床样品经过处理后，在Vero细胞中连续体外培养传代，进行病毒分离。其中编号为201602的样品在连续传代后仍然可以感染Vero細胞引起明显的细胞病变（CPE），将该分离的毒株命名为HB201602，并测定了病毒效价，其效价为1.0×105.6 TCID50/0.1 mL。
　　2.3  间接免疫荧光（IFA）鉴定
　　利用抗PEDV S蛋白的特异性单克隆抗体MAb（4C7株），对PEDV分离株HB201602感染细胞进行间接免疫荧光检测。结果表明，分离毒株HB201602感染Vero细胞后，能被抗PEDV S蛋白的特异性单克隆抗体所识别，在荧光显微镜下可观察到特异性的绿色荧光，证实所分离毒株为PEDV病毒，且能在Vero细胞中复制增殖（图2）。
　　2.4  HB201602分离株S1基因序列测定及其进化分析
　　以PEDV临床分离毒株HB201602提取的RNA为模板，RT-PCR扩增S基因部分片段，PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，并将位于850 bp处的DNA产物通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化，克隆至T载体上，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。并与NCBI GenBank中下载的国内外PEDV参考毒株S1基因进行序列比较分析，利用MEGA软件对包括HB201602分离毒株在内的33株PEDV S1基因进行进化分析（图3）。 　　2.5  S1蛋白表面抗原突變分析
　　以PEDV临床分离毒株HB201602提取的RNA为模板，RT-PCR扩增S1基因部分片段，并对其基因序列进行测定。以NCBI中32株PEDV毒株S1基因为研究对象，进一步分析了S1基因的遗传变异规律（图4）。
　　3  讨论
　　自2010年中国暴发猪流行性腹泻疫情以来，PEDV已迅速席卷了中国各地，给养猪业造成了巨大的经济损失[15]。本研究从湖北省规模化养殖场临床腹泻病料中成功检测并分离获得了一株猪流行性腹泻病毒，分离毒株感染Vero细胞可引起明显的细胞病变，病毒效价经测定达1.0×105.6 TCID50/0.1 mL。间接免疫荧光检测结果显示，分离毒株HB201602感染Vero细胞后，能被抗PEDV S蛋白的特异性单克隆抗体所识别，在荧光显微镜下可观察到特异性的绿色荧光，进一步证实所分离毒株为PEDV病毒。
　　冠状病毒的S蛋白主要识别宿主细胞受体，与之结合并诱导产生中和抗体，S蛋白的变异会导致致病性、免疫原性以及组织趋性的变化[16，17]。此外，S蛋白是协助病毒进入宿主细胞的重要结构蛋白，由S1和S2亚基组成，S1较S2更易发生突变[18，19]。因此，对HB201602的S1基因进行了序列测定，并从NCBI上选取了32株PEDV菌株，根据S1基因构建了系统发育树，发育树将PEDV分为G1和G2型，其中G1细分为G1-a亚型（经典毒株及其来源的疫苗毒株）、G1-b亚型（S-INDEL毒株），G2细分为G2-a亚型（变异毒株）、G2-b亚型（重组毒株）。通过分析PEDV毒株的分离时间，发现2011年后分离的毒株大多以G2型变异毒株为主。临床分离毒株HB201602与AJ1102、YN15、YN30、YN4-9、XY2013、
　　BJ-2011-1、GD-1、CH-HXIDZ-1-2012等同属于G2-a亚型（变异毒株）簇，亲缘关系上与AJ1102和LC最为接近，而经典毒株CV777位于G1-a分支上，提示HB201602为PEDV变异毒株。S1基因遗传变异分析显示，DR13-attenuated、PEDV-attenuated-vaccine等G1-b亚型毒株与其他簇毒株相比，在357-396位氨基酸处，存在9个特异的氨基酸突变（K357I359T359V361V366T367E368K381K396）。CV777、LZC等G1-a亚型经典毒株与其他簇毒株相比，在524-552位氨基酸处，存在4个特异的氨基酸突变（L524S526V530T552）。这些氨基酸的突变可能导致S蛋白的构象和功能变化，进一步导致疫苗匹配度降低，造成免疫失败，增加了PDEV预防和控制的难度。PDEV S蛋白的突变是否会引起免疫逃避，进而衍生更强毒力毒株的出现目前还不清楚，但对现阶段中国流行毒株S1基因的变异分析，将有助于了解PEDV的遗传变异趋势，为新型疫苗的研发提供理论依据。
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