小单孢菌211003的分离及16S rRNA基因序列分析

来源:用户上传      作者: 徐小雄 林海鹏 谢晴宜 洪葵

　　摘要小单孢菌211003分离自海南红树植物海膝根围土壤，采用干热100 ℃、60 min的预处理，葡萄糖天门冬素培养基（GA）作为分离培养基。该菌株革兰氏阳性，橘黄色基内菌丝，产单个孢子。经16S rRNA基因序列分析，归到小单孢菌属，并成一独立分支。并与M. siamensis TT2-4T的相似率最高，为98.415％。初步判定菌株211003为小单孢菌属一个潜在的新种。
　　关键词小单孢菌；分离；16S rRNA基因序列
　　中图分类号Q939.13+9；Q78文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）11-0047-02
　　
　　Isolationand16SrRNAGeneSequenceAnalysisofMicromonosporasp. 211003
　　XU Xiao-xiong 1，2LIN Hai-peng 3XIE Qing-yi 3HONG Kui 3
　　（1 Qiongzhou University，Sanya Hainan 572022； 2 Hainan Key Laboratory for Herpetological Research；3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology）
　　AbstractUsing pretreatment of hot heat 100 ℃ for 60 min，Micromonspora sp. 211003 was isolated from GA-vitamin selective media.The strain is G+，and single spores were formed on yellowish substrate hyphae. An almost-complete 16S rRNA gene sequence analysis showed the isolate was assigned to the genus Micromonospora and was form a cluster separately. The highest levels of similarity were with M. siamensis TT2-4T（98.415％）.Based on the analysis，the isolate should be a new member of Micromonospora.
　　Key wordsmicromonospora；isolation；16S rRNA gene sequence
　　
　　小单孢菌科最初是1938年由Krassil' nikov 建立的。按照1997年Stachebrandt 等建立的新分类系统，小单孢菌科在放线菌分类中属于细菌域，放线菌门，放线菌纲（亚纲），放线菌目，小单孢菌亚目，在小单孢菌亚目中只有1个小单孢菌科[1]。小单孢菌属作为小单孢菌科的代表属，于1923年建立，该属微生物是一类丝状原核微生物，为革兰氏阳性菌，不抗酸，兼性好氧，对pH值6.0以下敏感，但部分菌株能在pH值为10时生长。
　　小单孢菌生长温度范围是8～55 ℃，无气生菌丝，基内菌丝发达，分支，有隔。在基内菌丝上长单个孢子，有梗或无梗，孢子不能游动。细胞壁含meso-DAP 和甘氨酸（Ⅱ型）。全细胞水解物含阿拉伯糖和木糖（D型）。特征性磷脂是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇甘露糖苷，属磷脂PⅡ型。主要的甲基萘醌有MK-9（H4），MK-10（H4），MK-10（H6）或MK-12（H4，H6，H8）。DNA的（G+C）摩尔百分比含量为71%~73%。
　　1材料与方法
　　1.1样品采集与处理
　　1.1.1土壤样品采集。从文昌头苑红树林（北纬19°37′22″，东经110°47′44″）采集海漆（Excoecaria agallocha Linn）的根围土壤。
　　1.1.2土壤样品的理化指标检测。对土壤样品的有机质、全氮、全磷、全钾、全硫、有效磷、有效钾百分比含量及pH值、盐度、含水率测定（部分结果由中国热带农业科学院橡胶研究所完成）。
　　1.1.3预处理。土壤样品采集后置于阴凉处7 d，自然风干，干热100 ℃，60 min；将1 g土壤置于9 mL的1/4格林溶液1/10的稀释液，超声波处理10 min；然后用1/4格林溶液稀释得到1/100、1/1 000的溶液，备用。
　　1.2选择性分离放线菌
　　1.2.1培养基配制。葡萄糖天门冬素培养基（GA），葡萄糖均添加了终浓度为50 mg/L的放线菌酮、制霉菌素和重铬酸钾；复合维生素，每1 L培养基添加VB 0.5 mg、VB 0.5 mg；VB0.5 mg；烟酸0.5 mg；肌醇0.5 mg；泛酸0.5 mg；生物素0.25 mg；对-氨基苯甲酸0.5 mg。ISP 2培养基。
　　1.2.2菌株分离纯化与保藏。采用稀释平板分离法分离菌株，取1/10、1/100、1/1 000稀释液各100 μL涂布到GA培养基，设3个平行样。涂布平板置28 ℃恒温培养28 d，根据平板上菌落的形态特征，选取平板上所有的代表性菌落，挑取到ISP2琼脂培养基上，采用三步划线法纯化获得单菌落。纯化好的菌株保藏到20％的甘油管中，置于-20 ℃保藏[2]。
　　1.316S rRNA基因序列分析
　　1.3.1DNA模板的制备。采用核酸提取仪法提取放线菌的基因组DNA，为PCR扩增提供模板。其具体步骤如下：①在平皿上直接挑取100 mg菌体到Lysing matrix A tube中。Lysing matrix A tube事先装好小珠子，并灭菌。②加入500 μL无菌水。③在DNA快速提取仪Fastprep中振荡30 s，速度设置为5.0。④加入500 μL比例为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，涡旋振荡10 s，室温静置几分钟，14 000 g离心5 min。上清液即可用作PCR模板，可通过电泳检测是否含有放线菌的基因组DNA。
　　1.3.216S rRNA基因的PCR扩增及测序。PCR反应体系：模板DNA，1 μL；2×PCR mastermix，25 μL；1492R（20 μmoL/L），1 μL；27F（20 μm/L），1 μL；ddH2O，22 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性60 s；55 ℃ 退火60 s；72 ℃延伸90 s（30个循环）；72 ℃后延伸10 min。PCR产物直接送上海生工测序。
　　1.3.316S rRNA基因序列的系统发育分析。将测序得到的16S rRNA基因序列上传到GenBank上，获取Genbank号码。然后放到GenBank中进行比对，然后从GenBank、EMBL或DDJB上下载相似率高（一般＞98％）的相关菌属的模式菌株（Type strain）的16S rRNA基因序列，采用邻接法（Neigh-bour Joining）[3]构建聚类分析图，主要软件包括MEGA 4.0、BIOEDIT 7.0，初步确定菌株分类归属。

　　2结果与分析
　　2.1土壤样品主要化学成分分析结果
　　头苑红树植物海漆根围土壤的主要化学成分析结果为：有机质2.422％；全氮0.088％；全磷0.041％；全钾0.520％；全硫0.182％；有效磷214.8 mg/kg；有效钾188.9 mg/kg；pH值7.31；盐度40‰；含水率31.85％。
　　2.2菌株211003的初步鉴定
　　菌种211003分离自GA培养基，革兰氏阳性，在纯化培养基ISP 2上菌落呈橘黄色，无气生菌丝，通过显微镜可观察到单个孢子着生在基内菌丝上。
　　2.316 S rRNA基因序列分析
　　菌株211003的 16 S rRNA基因序列的GenBank序号为EU600087，通过16S rRNA基因序列聚类分析树的结果（图1）分析，初步判断菌株211003归到小单孢菌属，并且在小单孢菌属里面成为独立的一支。进一步分析其与小单孢菌属中有效种的16S rRNA基因序列相似率分析，菌株211003的16S rRNA基因序列与M. siamensis TT2-4T的相似率最高，为98.415％；其次是M. humi P0402T，为98.017％；再次是M. tulba-ghiae TVU1T，为97.891％。由此初步判断，菌株211003极有可能是小单孢菌属中的一个潜在新种。
　　3结论与讨论
　　菌株211003与其他的小单孢菌属的有效种的16S rRNA基因序列相似率最高为98.415％，其构建的聚类分析树结果显示，菌株211003独立于其他的小单孢菌，为单独的一支，作为该属的一个潜在新种的可能性非常大。近年来，红树林分离得到一些的新属、新种，具有丰富的放线菌资源，如从海南红树林环境中分离并发表了继生菌属（Jis-hengella endophytica）[4]、根围小单孢菌（Micromonospora rhizos-phaerae）[5]、三亚链霉菌（Streptomyces sanyensis）[6]、海南野野村菌（Nonomuraea wenchangensis）[7]、海南阿萨诺菌（Asanoa hainanensis）[8]。其中根围小单孢菌、海南野野村菌、海南阿萨诺菌分离自红树植物的根围土壤，并且根围小单孢菌跟菌株211003菌分离自同一份样品海膝根围土壤。试验结果表明，菌株211003是新种的可能性非常大，需要进一步进行形态、生理、生化及DNA杂交的鉴定工作[9-11]。
　　4参考文献
　　[1] 徐丽华，李文均，刘志恒，等.放线菌系统学――原理、方法及实践[M].北京：科学出版社，2007.
　　[2] 徐小雄，林海鹏，阮继生，等.从红树植物根际土壤选择性分离小双孢菌[J].微生物学通报，2009，36（9）：1299-1304.
　　[3] SAITOU N，NEI M.The neighbor-joining method：a new method for rec-onstructing phylogenetic tree[J].Mol Biol Evol，1987（4）：406-425.
　　[4] XIE QING-YI，WANG CHENG，WANG RONG，et al.Jishengella endop-hytica gen.nov，sp.nov，a new member of the family Micromonosporaceae[J].Int J Syst Evol Microbiol，2011（61）：1153-1159.
　　[5] WANG CHENG，XU XIAO-XIONG，QU ZHI，et al.Micromonospora rhi-zosphaerae sp.nov.，isolated from mangrove rhizosphere soil[J].Int J Syst Evol Microbiol，2011（61）：320-324.
　　[6] SUI JIN-LEI，XU XIAO-XIONG，QU ZHI，et al.Streptomyces sanyensis sp nov，isolated from mangrove sediment[J/OL].Int J Syst Evol Microbiol，2010 0：ijs.0.023515-0，in press.
　　[7] WANG FAN，XU XIAO-XIONG，QU ZHI，et al.Nonomuraea wenchan-gensis sp.nov，isolated from mangrove rhizosphere soil[J/OL].Int J Syst Evol Microbiol，2010 0：ijs.0.025742-0，in press.
　　[8] XU XIAO-XIONG，QU ZHI，WANG HAI-LONG，et al.Asanoa hainan-ensis sp.nov，isolated from rhizosphere soil of Acrostichum speciosum in a mangrove[J/OL].Int J Syst Evol Microbiol，2010 0：ijs.0.025825-0，in press.
　　[9] 李莉，闫淑珍，李玉梅.水稻田小单孢菌的选择性分离及鉴定[J].江苏农业科学，2010（2）：381-384.
　　[10] 龙中儿，朱跃进，黄运红，等.一株具有广谱抗菌活性小单孢菌的分离和鉴定[J].微生物学通报，2008，35（3）：378-383.
　　[11] 张学武，张建丽.小单孢菌属的分类及应用研究[J].微生物学通报，2006，33（5）：117-121.
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

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