甜樱桃 B类MADS-box基因的分离与序列分析

来源:用户上传      作者: 林苗苗 赵长竹 顾红 张慧琴 陈锦永 谢鸣 方金豹

　　摘 要：为研究MADS-box基因在甜樱桃花发育中的作用，以甜樱桃品种拉宾斯为试材，根据多种植物MADS-box基因保守序列设计引物，采用RT-PCR和RACE方法克隆基因cDNA全长，并用半定量PCR法研究基因在不同组织中的表达。克隆得到1个基因全长962 bp，命名为PaMADS2（GenBank登录号：HQ229606），包含1个633 bp的开放阅读框，编码210个氨基酸。序列比对和进化分析表明，PaMADS2与B类的PI基因家族亲缘关系最近。组织特异性分析表明PaMADS2在雄蕊和花瓣中表达。推断所克隆的PaMADS2基因为MADS-box B类家族成员。
　　关键词： 甜樱桃； 花器官； 雄蕊； 花瓣； MADS-box
　　中图分类号：Ｓ６６2．5 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1082－０4
　　
　　Isolation and sequence analysis of B-class MADS-box gene in sweet cherry
　　LIN Miao-miao1， ZHAO Chang-zhu1， GU Hong1， ZHANG Hui-qin2， CHEN Jin-yong1， XIE Ming2， FANG Jin-bao1*
　　（1Key Laboratory for Fruit Tree Growth， Development and Quality Control， Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou，Henan 450009 China； 2Institute of Horticulture， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou，Zhejiang 310021 China）
　　Abstract: To study the role of MADS-box genes in floral development of sweet cherry， MADS-box gene was isolated from Prunus avium L. Lapins with RT-PCR and RACE approaches. Primers were designed according to the conservative region sequences of various plant MADS-box family genes， and semi-quantitative PCR was used to analyze the expression of gene in different organs and tissues. The full length of cDNA is 962 bp， named PaMADS2 （the accession numbers in GenBank: HQ229606）， with an open reading frame （ORF） of 633 bp and encoding 210 amino acid residues. Sequence comparison and phylogenetic analysis indicated that PaMADS2 closely resembles the PI clade of class B. Tissue specific analysis showed that PaMADS2 expressed in petal and stamen. The results suggested that PaMADS2 belongs to the B-class MADS-box gene family.
　　Key words: Sweet cherry （Prunus avium L.）； Floral organs； Stamen； Petal； MADS box
　　MADS-box基因是一类编码转录因子的基因家族，最先是在酿酒酵母（MCMI）、拟南芥（AG）、金鱼草（DEF）和人类（SRF）中发现的，故为MADS[1-4]。在高等植物中，MADS-box基因由4个保守程度不同的区域组成，分别为M、I、K、C区域，即MIKC型MADS-box基因[5]，其按功能可分为A、B、C\D、E 4个亚家族[6]。花器官中雄蕊的发育是由ABC模型中的B类和C类基因共同调控的[7]，而几乎所有的B类基因都属于MADS-box基因家族，拟南芥的B类PI基因在花瓣和雄蕊中表达，李属中苹果和桃也有类似报道[8-9]。
　　甜樱桃在栽培过程中如在花芽分化期和花期遭遇高温[10-13]，会使花粉发育畸形，进而影响坐果。由于甜樱桃花具有完整的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊 4轮结构，我们采用RT-PCR和RACE方法，从甜樱桃中分离控制其雄蕊发育的B类 MADS-box基因，并对其进行表达特征研究，为了解甜樱桃雄蕊异常的分子机理以及MADS-box基因在雄蕊发育中的调控作用奠定基础。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　甜樱桃品种为6 a生拉宾斯（Prunus avium L. cv. Lapins），定植在中国农业科学院郑州果树研究所试验园内。基因克隆所用材料为雌蕊分化后期的花芽。组织特异性表达分析所用的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊取自拉宾斯盛花期花朵。所有材料均用液氮处理，-80 ℃冻存备用。
　　1.2 甜樱桃花芽RNA提取及cDNA合成
　　用改良CTAB法提取花芽RNA，用cDNA synthesis kit（MBI）合成cDNA，按照kit说明书进行。
　　1.3 PaMADS2基因cDNA片段的克隆
　　根据多种植物MADS-box基因核酸保守区，设计PCR引物扩增。PaMADS2上游引物为：5’-TAT CCACTTCATTGCTGAGGTTC-3’；PaMADS2下游引物为：5’-CAACAGCAGGTCACTTACTCTA-3’。PCR反应体系为25 μL，循环参数为:94 ℃ 10 min； 94 ℃ 30 s； 55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min； 34 cycles。回收目的片段克隆到pMD19-T载体上，转入大肠杆菌DH5ａ菌株，测序及序列分析。
　　使用clontech RACE kit进行5’RACE和3’RACE，PaMADS2 的3’ RACE引物序列为：5’-GGAGAGTGGAGCTGAAGAGG-3’；5’RACE引物序列为5’-GTGGCTCTTTCGCTGAAGAT-3’，按kit说明书进行操作，回收扩增产物，克隆到pMD19-T载体上，转入大肠杆菌DH5ａ菌株，进行蓝白斑筛选后进行双向测序、拼接分别得到PaMADS2基因全长。
　　1.4 氨基酸序列同源性分析
　　通过NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov） 中Blastx对PaMADS2进行同源性搜索和比对，利用Clustal X软件进行同源性分析，使用MEGA软件NJ法构建系统发育树[14]。

　　1.5 PaMADS2组织特异性分析
　　提取盛花期萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊总RNA，cDNA synthesis kit（MBI）合成cDNA，半定量分析所用引物与克隆片段引物相同。
　　2 结果与分析
　　2.1 基因分离，序列拼接与全序列分析
　　对雌蕊分化后期的花芽进行PCR扩增，分离出233 bp中间片段，在NCBI上Blast比对测序，结果表明该片段与多种植物的MADS-box基因有较高的同源性，证明该片段为所需的目的片段。采用RACE技术，分别获得3’端和5’端目的片段，序列拼接得到962 bp的基因全长，命名为PaMADS2，GenBank的登录号为HQ229606。PaMADS2基因含有1个633 bp的开放阅读框，编码210个氨基酸（图1），分子量24.5 ku，等电点8.72，是一个碱性蛋白。
　　利用NCBI中的Blastx工具把PaMADS2核酸序列翻译为氨基酸序列，与其他植物的PI-like MADS-box蛋白比对，结果表明，PaMADS2与ABC模型中的B类基因有较高的同源性，含有一个保守的MADS区和半保守的K区（图2），其中与桃（Prunus persica）PrpMADS10（Genbank 登录号：ABS32248）的同源性为97%，与苹果MdPI（Genbank登录号：CAC28022）的同源性为86%，与金鱼草（Antirrhinum majus）GLO的同源性为63%（Genbank 登录号：CAA48725），与拟南芥（A. thaliana）PI的同源性为57%（Genbank 登录号：BAA06465）。
　　2.2 PaMADS2蛋白的系统发育分析
　　选择花同源MADS-box基因的4个亚家族中的典型MADS-box基因，利用MEGA软件，构建系统进化树（图3）。系统进化关系分析表明：PaMADS2基因编码蛋白与ABC模型中的AP3/PI-like（B类）基因编码蛋白同源性较高，其中与桃中的PpMADS10基因编码蛋白亲缘关系最近，所以把PaMADS2基因归于AP3/PI基因亚家族。
　　2.3 PaMADS2组织特异性分析
　　半定量RT-PCR分析表明，PaMADS2基因在花瓣和雄蕊中表达，在萼片和心皮中不表达，这与同源性较高的拟南芥的PI基因的组织表达情况一致，进一步说明其应属于B类基因（图4）。
　　
　　3 讨 论
　　目前已经分离出大量木本植物的B类MADS-box基因[9，15]，B类MADS-box基因影响雄蕊的正常发育，但调控这些性状的分子遗传机制尚不十分清楚。本试验根据MADS-box基因在M区高度保守的特征，在NCBI上搜索不同物种的MADS-box基因并进行核酸、蛋白比对以及系统进化分析，设计同源特异性引物，利用RT-PCR和RACE技术，我们克隆得到一个PaMADS2 基因，该基因具有完成的ORF以及3’-UTR和5’-UTR，推断的蛋白质具有完整的M区和K区。
　　在基因表达上，PaMADS2在甜樱桃花器官的第2轮和第3轮表达，而在第1轮和第4轮不表达，这与拟南芥的PI基因表达模式一致[16]；从系统进化分析来看，其与桃的PpMADS10、苹果的MdPI基因亲缘关系最近，所以我们推测其应属于B类MADS-box基因家族成员。
　　同源性分析表明，PaMADS2与李属的桃PpMADS10和苹果的MdPI基因高度同源；苹果MdPI基因能够调控其雄蕊发育，其突变体在不授粉时由于其自身突变的MdPI不能正常表达而形成无核果实[17]。温度可影响苹果MdPI的表达，当MdPI转拟南芥PI突变体后，培养温度变化可使F2代出现轻微的花器官同源异型转换[17]，而温度是怎样调控基因表达的尚不清楚。已有研究中，温度使植物体内的赤霉素水平发生变化，而赤霉素信号转导过程中的某些调控因子可能影响MADS-box基因的表达，所以温度通过怎样的途径影响MADS-box基因的表达，有待进一步研究。
　　温度可调控 MADS-box基因的表达[18]，雌雄性器官发育对温度的要求也不同[19]，PaMADS2在不同温度时雄蕊中的表达状况我们将在后续的试验中完成，以期了解PaMADS2的生物功能以及可能的调控途径。
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