广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金检测试纸条的研制及应用

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　　摘要    为建立一种在生产应用中快速简便的CMV检测方法，应用胶体金标记技术和免疫层析原理，研制出一种针对广东烟区黄瓜花叶病毒病的快速检测试纸条。检测结果表明，该试纸条检测病毒的灵敏度为1 g/103 mL。对烟草上危害严重的其他4种病毒均无特异性反应。用试纸条对育苗棚烟株进行随机检测，结果与RT-PCR检测结果相符率为90%。
　　关键词    胶体金试纸条;黄瓜花叶病毒;广东烟区
　　中图分类号    S435.72        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）08-0099-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Abstract    In order to establish a rapid，specific and simple method for detection of cucumber mosaic virus，using colloid gold labeling technique and immunochromatography principle，rapid test strip for CMV in Guangdong tobacco area were developed.The test results showed that the sensitivity of the test strip to virus detection was 1 g/103 mL.None of the other 4 viruses，which were seriously harmful to tobacco，had specific reaction.The test strip was used to test the tobacco seedlings of the seedling shed randomly，and the result was 90% in accordance with the results of RT-PCR.
　　Key words    colloid gold strip;CMV;Guangdong tobacco area
　　黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）属于雀麦花叶病毒科（Bormoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cuucmovirus）[1]。其寄主范围特别广泛，能侵染100科超过 1 200 种的单子叶和双子叶植物[2]。CMV是引起番茄花叶病、烟草花叶病等的主要病原。在很多寄主中，CMV还可以与其他病毒协生，加重病毒的致病性[3]。因其寄主范围的普遍性与引起病害的重要性，CMV已成为全球最重要的植物病毒之一。
　　快速、准确地检测病毒，对提高烟叶生产效益具有重要意义。防治CMV主要采用抗病毒育种和生产无毒种苗等方法[4-5]。目前病毒的检测主要通过电子显微镜观察、ELISA和PCR等方法[6]。在实际应用中，电镜检测和PCR需要有昂贵的仪器;ELISA耗时很长。因此，在烟叶生产实践上应用这些方法进行病毒检测具有局限性[7]。胶体金免疫层析技术操作简单、灵敏，无需特殊设备便可大规模检测[8]，广泛应用于食品安全监督、动植物检疫等领域[9-14]。
　　為了满足基层生产单位针对烟草、蔬菜上CMV的快速检测需求，本研究通过构建广东烟草CMV的单克隆抗体，利用双抗夹心法，研制出可在10 min内同时快速定性检测CMV的胶体金试纸条。
　　1    材料与方法
　　1.1    试验材料
　　1.1.1    试剂及器材。氯金酸、兔抗鼠二抗[15-16]，购自Sigma公司;柠檬酸三钠（分析纯）、BSA，购自广州精科生物科技有限公司;试验用水，电阻率 ≥18.2 MΩ，为经超纯水装置净化的二次去离子水。RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒[15，17]，由天根生化科技（北京）有限公司生产。Protein A-Agarose亲和柱，购自GE Healthcare公司。硝酸纤维素膜、玻璃棉、支持板、玻璃纤维、吸水纸，购自德国S.S公司。
　　1.1.2    毒源。PVY、TMV、马铃薯A病毒（potato virus A，PVA）、烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus，TEV）、番茄斑萎病毒（TS-WV），来自华南农业大学植物病毒研究室。CMV，为华南农业大学植物病毒研究室保存的的普通株系[15]，摩擦接种并保存于系统侵染寄主三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun）上。
　　1.1.3    引物序列。以CMV的CP基因为模板设计引物，进行RT-PCR扩增，引物序列如下：
　　扩增片段长度为250 bp。 　　1.1.4    烟苗。本实验室育苗棚常规培育烟苗100株，品种为K326。采自广东省各烟区疑似感染病毒样本150份，品种为K326和云烟87。
　　1.2    试验方法
　　1.2.1    CMV抗原的制备。CMV粒子的提纯方案采用文端志等[18]的方法进行。
　　1.2.2    CMV单克隆抗体的制备。由提纯的病毒颗子作为抗原免疫BALB/c雌性小鼠。72 h后取免疫小鼠的SP2/0细胞与脾细胞，通过PEG[19]法融合。经过培养、筛查，分别获得表达3种病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。腹水的制备参照尚海丽等研究方法[20]。采用Protein A-Agarose亲和柱进行腹水的亲和纯化，参照产品说明书使用方法，将纯化后的单抗于-80 ℃冰箱中保存，待用。
　　1.2.3    胶体金的制备。采用柠檬酸三钠还原法[21]制备胶体金溶液，所得胶体金溶液粒径为25 nm。
　　1.2.4    胶体金的标记。量取20 mL胶体金溶液，将pH值调至8.5，将0.1 mg病毒单克隆抗体搅拌加入，搅拌 时间30 min，再加入终浓度20%的PEG-20000稳定未结合的胶体金颗粒，在8 700 r/min条件下离心30 min，去除上清，再用金标缓冲溶液定容至 1 mL，于4 ℃条件下保存，待用。
　　1.2.5    金标垫的制备。在金标垫上均匀涂布标记好的胶体金溶液，将此金标垫放置于37 ℃条件下烘干120 min，待用。
　　1.2.6    质控线和检测线的包被。用硝酸纤维素膜分别包被兔抗鼠IgG二抗和病毒单克隆抗体，作为质控线和检测线，放置于37 ℃条件下烘干120 min，待用。
　　1.2.7    病毒检测试纸的制备。在背衬板上依次粘贴已制备好的硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫和吸水纸，并用切条机切割成8 mm的条，装入卡壳，封装于铝箔袋中（此铝箔袋内事先装有干燥剂）。放置于4～28 ℃条件下保存，待用。
　　1.2.8    样品检测和判定标准。取感染病毒的烟草叶片，加入PBS液磨碎。取3～4滴混合液缓慢滴加到加样孔中，放平试纸卡，160 s内观察结果。判定标准：若质控线处不出现显色条带则表示试纸条失效。若试纸条上除质控线出现条带，检测线处也出现一显色的条带，则为阳性结果。若在试纸条上只有质控线出现一条显色的条带，检测线无条带，则为阴性结果。
　　1.2.9    灵敏度试验。将含有CMV的植物叶片研磨，分别制备成1 g/10 mL、1 g/102 mL、1 g/103 mL、1 g/104 mL、1 g/105 mL、1 g/106 mL的检测液。取多重病毒检测试纸条进行检测，测试其灵敏度。
　　1.2.10    特异性试验。用本研究开发的病毒检测试纸条分别检测TMV、PVY、PVA、TSWV，测试其检测病毒的特异性。
　　1.2.11    稳定性试验。将制备好的CMV快速检测试纸密封后在室温（10～37 ℃）下保存，并在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月后取出，分别检测阴性和用CMV提纯病毒配制的阳性样品，分析其稳定性。
　　1.2.12    符合率测试。用本研究开发的病毒检测试纸条检测供试烟苗。同时，抽提每株烟苗的总RNA，进行RT-PCR扩增，检测其是否携带病毒。比较2种方法检测结果的符合率。
　　2    结果与分析
　　2.1    分泌病毒单抗的杂交瘤细胞株获得
　　取免疫小鼠脾脏细胞和对数生长期的SP2/0鼠骨髓瘤细胞，通过聚乙二醇融合获得杂交瘤细胞[15-16]，杂交瘤细胞经HAT培养基筛选和培养12 d。用作包被抗原的是感病的烟草组织粗提液，检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体采用间接 ELISA 方法[15，17]，最终获得13株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤細胞株。
　　2.2    单抗腹水制备、亚类鉴定
　　分别取分泌不同病毒的杂交瘤细胞注入已用降植烷处理的8周龄BALB/c小鼠腹腔内[15]，7～10 d后收集单抗腹水。腹水抗纯化后的IgG含量为1.87～3.35 mg/mL。采用 Sigma公司的抗体类型和亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的抗体类型及亚类[16-17]。鉴定结果表明，13株CMV中有8株 IgG1、3株IgG2a、2株IgG2b[15]。
　　2.3    灵敏度试验
　　本文制备的病毒试纸条检测CMV最低浓度1 g/103 mL，结果见图1。
　　2.4     特异性试验
　　本研究开发的病毒试纸条检测目标病毒的特异性好，结果见图2，可以看出，试纸条分别检测CMV、TMV、PVY、PVA、TSWV的测试结果。
　　2.5    稳定性试验
　　制备好的CMV胶体金试纸条分别在第 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月后取出检测阴性及阳性样品，检测线和质控线的显色无明显变化，表明试纸稳定性很好。
　　2.6    符合率测试
　　分别在广东南雄和始兴烟草育苗大棚取样，对比试纸条和RT-PCR 2种检测方法的阳性检出率，结果如表1所示。可以看出，本研究研制的试纸条对目标病毒的检出与RT-PCR检出结果的符合率，南雄取样点的CMV为90%，始兴取样点的CMV为97.7%，说明试纸条同室内RT-PCR检测方法相比具有较高的符合率。 　　3   结论与讨论
　　由于双抗体夹心免疫层析法对抗体的要求较苛刻，需要针对2个不同位点的抗体才能用于配对检测[22]。从13株单克隆抗体中只筛选配对成功1对抗体，能满足检测灵敏度需要。因此，在后续研究中可继续进行免疫，以筛选出多株单克隆抗体，提高其配对几率。
　　本研究制备的CMV胶体金检测试纸条成本低廉，操作简便、快速，不需要特殊试验条件，检测结果易于肉眼判斷。其对目标病毒的检测特异性良好，敏感度达到1 g/103 mL，填补了国内CMV胶体金快速检测试剂的空白。在进行大量田间样品检测试验后确定本试纸能满足对田间样本快速、准确、灵敏的检测要求，并且操作简单方便，适合基层生产单位在烟草漂浮育苗期快速、大量检测CMV感染烟株，对减少CMV的感染、切断CMV的传播途径、筛选培育无病毒壮苗具有重要作用。
　　本研究制备的试纸条与RT-PCR检测的符合率略低，这是由于该样品含有的病毒量较低的缘故，但其高于90%的符合率完全可以替代进口产品使用。随着烟草及各种主栽作物绿色防控重大项目的开展，减少化学农药使用量、降低作物农药残留成为目前烟草生产目标。本研究针对广东烟区CMV病毒病研制的快速检测试纸，可以在烟草苗期通过快检技术筛查出可能的毒源，从而减少烟苗带毒移栽，可以降低植株的田间带毒率，减少田间抗病毒农药使用，减少经济损失，具有明显的经济和社会效益。
　　4    参考文献
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