胶体金免疫层析技术在食品安全现场快速检测中的应用

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　　摘要    胶体金免疫层析技术具有操作简单、价格低廉、特异性和灵敏度较高、肉眼易判断、检测时间短等特点，非常适合用于食品安全现场快速检测。本文从动物源性食品及植物源性食品两方面，对利用胶体金免疫层析技术进行食品安全基层监管以及食品企业原料现场快速检测应用研究进行了综述，并对胶体金免疫层析技术应用发展进行了展望。
　　关键词    胶体金免疫层析技术;食品安全;现场快速检测
　　中图分类号    TS207.7        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）04-0225-03                                                                                     開放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Abstract    Colloidal gold immunochromatography assay  has the characteristics of simple operation，low price，high specificity and sensitivity，easy judgment by the naked eye，and short detection time.It is very suitable for on-site rapid detection of food safety.This article reviewed the research on the application of colloidal gold immunochromatography assay for primary supervision of food safety and on-site rapid detection of raw materials of food companies from animal-derived food and plant-derived food.The application development of colloidal gold immunochromatography assay  was  prospected.
　　Key words    colloidal gold immunochromatography assay;food safety;on-site rapid detection
　　近年来，国家非常重视食品快速检测技术，在《食品安全法》《实用农产品市场销售质量安全监督管理办法》《食品快速检测方法评价技术规范》等相关法律法规中对利用食品快速检测技术进行食品安全检测监管进行了规定和规范[1]。
　　作为快速检测中重要的一部分，食品安全现场快速检测简单便携、成本比较低廉[2]，能够在产品仓库、生产场地、销售地点等现场对大批量的样品进行快速筛查（图1），极大地提高了食品安全监督、检验的效率，符合食品企业内部产品品质控制以及基层监管部门对食品质量安全管理的实际需求。
　　胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatogr-aphy assay，GICA）是将胶体金标记技术、免疫检测技术和蛋白层析技术相结合，以硝酸纤维膜（nitrocellulose filter mem-brane，简称NC膜）为载体的快速固相膜免疫分析技术[3]。该技术将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上之后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂之后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可以通过肉眼观察到显色结果[4-5]。以胶体金为免疫标记物方法的优点是操作简单、价格低廉、特异性和灵敏度比较高、肉眼容易判断、检测时间比较短，特别适合广大基层和大批量现场筛查。
　　1    GICA在动物源性食品现场快速检测中的应用
　　1.1    GICA在畜禽肉制品现场快速检测中的应用
　　目前，主要集中在动物疫病和兽药残留现场筛查，以及致病菌污染快速检测等方面。
　　1.1.1    在动物疫病现场筛查方面。针对引起动物疫病的病毒病菌进行检测，并和常规检测方法进行对比，明确GICA在现场筛查检测过程中的应用性。吴海涛等[6]针对2018年全国范围暴发的一类动物疫病非洲猪瘟（ASF），以原核表达的ASFV PET-30A-P72蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备血清，以ASFV单克隆抗体杂交瘤细胞株2D3接种至Balb/c小鼠腹腔内制备腹水，获得能在5～10 min内检测出含有非洲猪瘟病毒（ASFV）阳性抗原的胶体金试纸。Jiang等[7]利用双抗夹心GICA制备检测猪口蹄疫病毒测试条，其检测灵敏度可以达到11.7 ng/mL，检测时间控制在15 min以内。杨旭欣等[8]针对羊布鲁氏菌病进行研究，对299份羊血清同时利用GICA、虎红试管凝集试验（RBPT）和试管凝集试验（SAT）进行检测，其结果基本一致，进一步肯定了GICA在现场替代传统检测手段的可能性。张少华等[9]针对猪肉中寄生虫病，以胶体金标记猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组蛋白抗原研制出检测猪带绦虫的GICA试纸条，在5～15 min内简便快速获得准确结果，适用于一般的基层单位、养殖场对猪囊虫病常规实验室诊断和流行病学调查。 　　1.1.2    在兽药残留现场筛查方面。利用GICA技术对食品动物中违禁、残留兽药进行快速检测，并通过精密仪器复检，证明GICA技术在兽药残留现场筛查的实用性。吴雨豪等[10]以65 nm多枝状胶体金（Au NFs）为新型探针，研制检测猪尿中新型瘦肉精沙丁胺醇（SAL）的试纸条，仅需1台便携式读取仪，17 min内即可实现猪尿中SAL的高灵敏定量检测，其检测SAL的IC50值可达到0.143 ng /mL，猪尿样品最低检测限为0.027 ng /mL，适于SAL的现场快速筛查检测。赵兴然等[11]针对动物和水产养殖中常见的禁用药氨苯砜（DDS），依据免疫竞争法原理，建立了胶体金渗滤式试纸条快速检测方法，通过简单前处理，在10 min内可目测进行定性判断，最低检出限可达到20 μg/L，同时利用高效液相色谱法进行了试验结果验证，证明该方法检测结果准确，操作简便快速，适用于大批量临场动物性食品中氨苯砜残留的快速定性检测。高素敏[12]针对禽类产品中易滥用易残留的兽药磺胺嘧啶进行胶体金免疫层析试纸条研制，通过对当地采集的100份鸡肉样品进行检测并利用高效液相色谱法进行阳性样品复检，进一步证明GICA具有操作方便、灵敏度高、检测快速的效果，克服了传统检测方法的缺陷，有着较好的应用前景。
　　1.1.3    在致病菌污染快速检测方面。主要利用GICA克服传统微生物检测时间长、人员及设备要求高、不能进行现场快速检测等缺点，实现对动物源性产品致病菌及其毒素污染的简单便捷快速检测。赵  鑫等[13]针对在冷鲜肉中容易存活的致病菌单增李斯特氏菌，制备单克隆抗体，利用双抗夹心免疫原理制备出可检测单增李斯特菌的胶体金免疫层析试纸条，检测限可达到1×106 CFU/mL，与常见的食源性致病菌无交叉反应。张  帅等[14]利用免疫学技术，制备了特异性单克隆抗体和多克隆抗体，研制出胶体金免疫层析试纸条能够同时对鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌和福氏志贺氏菌这3种畜禽生鲜肉中最常见致病菌进行定性和半定量快速检测，检测灵敏度可以达到1×104 CFU/g，最大程度地降低检测成本。刘  晶等[15]针对畜禽肉制品中危害较大不易去除的金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）和B（SEB）建立双抗体夹心免疫层析测试卡检测法，能够在10 min内进行定性和半定量检测，对SEA的检测范围为10～100 ng/mL，灵敏度达到10 ng/mL;对SEB的检测范围为1～100 ng/mL，灵敏度达到1 ng/mL，以携带方便、使用简单、判定准确、结果客观、易保留的特点满足现场进行细菌毒素快速检测的要求。
　　1.2    GICA在食用水产品现场快速检测的应用
　　GICA在食用水产品中的应用主要集中在疫病病原、药物残留和水产毒素的现场快速检测。
　　1.2.1    在疫病病原的快速检测方面。主要利用GICA对水产养殖以及食用水产品中常见的病原菌进行快速检测。辛志明等[16]针对严重危害我国淡水养殖业的病原菌豚鼠气单胞菌制备出胶体金免疫层析试纸条，灵敏度达到1×106 CFU/mL，5 min内显示结果，适合在基层使用。宋佳蕾等[17]针对鱼类淋巴囊肿病病原淋巴囊肿病毒（LCDV）胶体金免疫层析试纸条，可在10 min内进行LCDV定性和半定量检测，并将检测结果与斑点免疫印迹法、ELISA检测进行对比，论证高灵敏性的GICA在现场快速检测的实用性。
　　1.2.2    在药物残留的快速检测方面。逐步对GICA检测方法进行规范化，2017年国家食药总局发布了利用GICA对水产中孔雀石绿（KJ201701）、硝基呋喃类代谢物（KJ201705）等药物残留的快速检测方法公告，对相关检测方法给予认可并加以规范[18]。广东省于2016年7月至2019年6月3年间，利用GICA检测方法共检测孔雀石绿项目42 458批次，检出不合格449批次，通过加标盲样测试和高效液相色谱-质谱串联LC-MS验证，证实该方法检出限、假阳性率和假阴性率均达到国家规定标准[19]。宗婧婧等[20]对我国严格规定水产中残留限量的15种喹诺酮类药物（QNs）建立了GICA快速检测方法，可在3～5 min之内获得和超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）一致的检测结果，15种喹诺酮类药物的检出限在0.3～5 μg/kg之间，是一种可广泛用于检测机构和水产企业的日常检验监测。但在水产毒素的快速检测方面，主要利用GICA快速简便的特点，对利用普通方法难以现场快速检测的水产毒素进行筛查和识别。早在2011年，Komano 等[21]就设计完成蛤蚌毒素GICA快速方法，其最低检出限为12 ng/mL。张世伟等[22]针对亚洲国家食用河豚的饮食习惯，建立了河鲀毒素GICA检测方法，只需10 min就可对热加工河豚产品中的毒素残存情况进行检测，最低检出限为20 μg/kg，為河鲀餐前快检提供了有力的技术手段。李晨望[23]利用胶体金-纳米二氧化硅（CNPs-SNRs）复合材料建立腹泻性贝类毒素GICA检测方法，检测限可达到15.5 ng/mL，方法特异性高、受干扰少，适于水产销售现场的快速筛查。
　　1.3    GICA在乳制品现场快速检测的应用
　　GICA在乳制品中的现场快速检测应用主要集中在药物残留、非法添加物以及掺假判别等方面。袁晓春[24]、赵福民等[25]、武晋孝等[26]利用GICA建立针对乳制品中残留的氨基糖苷类、大环内酯类和林可胺类抗生素的现场快速检测方法，通过液相色谱法及液相色谱-串联质谱法进行结果比对，证实了GICA方法在现场快速检测乳制品抗生素残留问题的有效性和适应性。白  宇等[27]针对乳制品中易滥用易残留的激素类药物雌二醇（E2）建立了快速、敏感、特异的GICA方法，通过对该方法的灵敏度、特异性、重复性和加速保存等参数以及交叉反应和干扰反应测定，证实了该方法的有效性。针对乳制品中非法添加三聚氰胺的问题，从尝试利用GICA方法进行三聚氰胺的筛查[28]到利用GICA高灵敏度快速检测[29-31]，GICA方法一直是现场快速检测乳制品中三聚氰胺的最佳选择。 　　2    GICA在植物源性食品现场快速检测中的应用
　　2.1    GICA在粮油安全问题现场快速检测中的应用
　　GICA在粮油安全问题现场快速检测中的应用主要集中在粮油及其制品中常见的真菌毒素、重金属及致癌物这几个方面。
　　2.1.1    在粮油中常见的真菌毒素检测方面。利用GICA技术进行定性定量检测是目前现场快速检测过程中最常见也是最流行的检测方法。粮油中黄曲霉毒素的GICA检测已经是非常成熟的检测技术，被广泛应用于粮油安全监测过程中[1-2]。近年来，针对黄曲霉毒素的GICA检测类型逐渐从大批量定性筛查向准确定性及定量检测发展。徐振斌等[32]建立了定量检测玉米中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的GICA检测法，检测限为1.0 μg/kg，定量限为3.0 μg/kg，能够满足基本检测要求。刘  静等[33]借助胶体金读取仪建立了高灵敏的定量检测黄曲霉毒素B1的GICA检测法，灵敏度为5.7 ng/L，能够满足实际工作中食品检测需求。粮油中常见的赭曲霉毒素[34]、玉米赤霉烯酮[35]、伏马菌素[36]等都是近年来GICA检测应用的主要对象。
　　2.1.2    在粮油的重金属及致癌物检测方面。GICA技术利用简单便捷的特点可弥补传统檢测方法对仪器及操作要求高不适应现场快速检测的问题。王  森等[37]采用免疫竞争法研制灵敏度1 μg/L、操作过程3～5 min、可用于快速检测重金属汞残留的胶体金免疫层析测试卡。刘美辰等[38]建立了快速定量检测糙米中重金属离子铅的胶体金免疫层析试纸条分析方法，检出限为0.041 mg/kg，定量限为0.097 mg/kg，与原子吸收光谱法检测结果一致。刘  波等[39]建立了快速检测食用油中致癌物苯并芘的胶体金免疫层析试纸条方法，检测限可达5～10 ng/mL，且与大部分苯并芘结构类似物无交叉反应。
　　2.2    GICA在果蔬安全问题现场快速检测的应用
　　GICA在果蔬安全问题现场快速检测的应用主要集中在果蔬农药残留检测方面。GICA技术能够解决基层果蔬农残大批量检测问题，又能够弥补农残速测卡法容易受环境影响出现假阳性等问题。早在2009年，机磷农药的胶体金免疫层析快速检测试纸条就已经被研发[40]，随着研究的深入，在检测时间、检测灵敏度等方面不断完善GICA技术在果蔬农残中的应用。按照《农残办技术材料要求及审查程序》要求，朱亮亮等[41]研制出针对辛硫磷、对硫磷、丙溴磷、氯唑磷等4种有机磷农药的胶体金免疫层析测试条，检测限均为200 μg/kg，检测时间仅仅为15 min，假阳性率和假阴性率均为0，适合应用到基层大批量样本检测中。许俊丽等[42]建立了戊唑醇免疫层析快速检测方法，可以在15 min内实现小麦、黄瓜和甘蓝中戊唑醇定性与半定量分析，最低检测限为6.25 ng/mL，分析结果与高效液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）方法的检测结果一致，可以满足现场快速筛查大量样品的需求。
　　3    展望
　　胶体金免疫层析技术以其生产成本低、操作简单、检测快速、灵敏度高、特异性强、肉眼易判断、技术操作要求低等优点被广泛应用于食品安全现场快速检测中，备受基层监管部门和中小型食品企业的欢迎。有效提高免疫标记技术的敏感性、特异性，并实现高通量检测、定量或半定量检测，不断扩大胶体金免疫层析技术的应用广度和深度是该技术应用发展的主要趋势。同时，进一步降低胶体金免疫层析检测产品的价格，全面推广普及胶体金免疫层析技术的应用，对于在全国范围内加强食品安全基层监管、提升中小企业自检效率、提高民众食品安全意识具有重要的经济价值和社会价值[43-45]。
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