免疫荧光法在微生物快速检验中的应用分析

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　　【摘要】 目的 探讨免疫荧光法在微生物快速检验中的应用价值。方法 150例确诊为上呼吸道感染患者， 对所有患者的鼻、咽、喉部分泌物标本采用免疫荧光法进行快速检验， 观察分析所有患者的病毒感染率与病毒感染种类。结果 150例患者病毒感染135例， 病毒感染率为90.00%;其中腺病毒感染38例（28.15%）， 占比最高， 其次流感病毒A为28例（20.74%）、流感病毒B为22例（16.30%）、呼吸道合胞病毒为17例（12.59%）、副流感病毒2为11例（8.15%）、副流感病毒3为11例（8.15%）、副流感病毒1为8例（5.93%）。结论 免疫荧光法可快速检验上呼吸道感染患者病毒感染率与病毒感染种类， 可作为患者疾病进展与预后判断的参考依据， 推荐临床广泛应用。
　　【关键词】 免疫荧光法;微生物;快速检验;上呼吸道感染
　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.044
　　免疫荧光技术是结合免疫学方法与荧光标记技术来研究特异性蛋白抗原在细胞内分布情况的一种研究技术， 主要是由于荧光素所散发出来的荧光可被荧光显微镜检出， 进而可对抗原进行精准的细胞定位[1]。此方法不仅检验速度快， 而且敏感度与特异度均较高， 现已成为诊断学中最常用的方法之一， 临床常将其应用于细菌、真菌以及病毒等微生物的快速检验中， 且取得了满意效果[2]。临床发现， 大部分的上呼吸道感染是由病毒感染引起， 常见病毒包括流感病毒、副流感病毒、腺病毒以及呼吸道合胞病毒等[3]。准确地诊断致病病毒类型， 再给予针对性治疗对患者预后改善具有重要意义。本研究选取了150例上呼吸道感染患者， 对其鼻、咽喉分泌物标本采用免疫荧光法进行快速检验， 具体报告如下。
　　1 资料与方法
　　1. 1 一般资料 选取2018年1月～2019年1月本院收治的150例确诊为上呼吸道感染患者作为本次研究对象， 其中男84例， 女66例;年龄12～77岁， 平均年龄（47.52±16.48）岁;身高155～192 cm， 平均身高（168.62±8.25）cm;体重43～95 kg， 平均体重（65.83±9.73）kg;文化程度：大专及以上25例， 高中48例， 初中53例， 小学及以下24例;疾病类型：鼻部感染65例， 咽部感染55例， 喉部感染30例;合并症：急性心肌炎11例， 风湿热6例， 肾炎5例。
　　1. 2 方法
　　1. 2. 1 试剂 使用美国DHI公司生产的荧光检测试剂盒， 具体包含荧光标志单克隆抗体试剂盒与荧光标志抗体试剂盒， 主要是针对流感病毒A、流感病毒B、腺病毒、呼吸道合胞病毒以及副流感病毒1、2、3型试剂盒;另外， 还有封闭液、浓缩型洗涤液以及病原体对照载玻片。
　　1. 2. 2 快速检验方法 ①标本收集和处理：a.使用负压吸引器取患者2～3 ml的鼻、咽及喉部分泌物， 然后将分泌物放置无菌生理盐水中待检。b.对分泌物进行反复性地吹打， 然后放置于离心管内。c.将分泌物离心， 控制转速为500 r/min， 离心时间为8 min， 除去上清液。d.将遗留下来的沉淀物使用磷酸盐缓冲液进行洗涤， 然后混合均匀。e.对沉淀物再次进行离心处理， 除去上清液， 重复多次， 直至上清液不再粘稠为止。f.将最后遗留的沉淀物溶解在0.5～1.0 ml的磷酸盐缓冲液中， 再进行反复吹打， 直至其成为细胞悬液为止。g.将细胞悬液点在病原体对照载玻片上， 保持每孔25 μl。h.风干点样孔， 然后使用冷丙酮对其进行固定10 min， 待检。②荧光染色：a.于对照载玻片样孔内细胞中滴入20 μl对应荧光抗体， 然后在37℃的保温盒内孵育30 min， 也就是在1～7號样孔内一次性地滴入荧光标志抗体进行阴性对照， 而采用荧光标志单克隆抗体作为阳性对照， 以流感病毒A、流感病毒B、腺病毒、呼吸道合胞病毒以及副流感病毒1、2、3型试剂盒作为样品孔。b.使用浓缩型洗涤液对载玻片内细胞进行反复洗涤， 然后使用蒸馏水充分洗涤1 min。c.等待蒸馏水完全风干之后， 在载玻片孔内再滴入1滴封闭液， 然后将盖玻片盖好， 最后使用荧光显微镜进行观察。
　　1. 3 诊断原则与阳性判断标准 ①诊断原则：当被荧光标志的对应病毒特异性单克隆抗体与其抗原相互结合之后， 形成了一种结合复合物， 使用荧光显微镜观察可发现为绿色荧光， 但未被染色的会被Evas蓝染而成为红色。②阳性判断标准：若荧光显微镜下显示为绿色荧光代表阳性， 若无荧光代表阴性;若荧光显微镜放大200倍时， 发现不低于2个荧光细胞则代表阳性。
　　2 结果
　　150例患者病毒感染135例， 病毒感染率为90.00%;其中腺病毒感染38例（28.15%）， 占比最高， 其次流感病毒A为28例（20.74%）、流感病毒B为22例（16.30%）、呼吸道合胞病毒为17例（12.59%）、副流感病毒2为11例（8.15%）、副流感病毒3为11例（8.15%）、副流感病毒1为8例（5.93%）。见表1。
　　3 讨论
　　上呼吸道感染是鼻腔、咽部及喉部急性炎症的总称， 从广义角度来说， 其不是一个疾病诊断， 而属于一组疾病， 包含普通感冒、咽结膜热、病毒性咽炎、喉炎、细菌性咽-扁桃体炎以及疱疹性咽峡炎等;从狭义角度来说， 也被成为普通感冒， 属于临床最常见的一种急性呼吸道感染疾病， 具有发病率高、自限性等特点[4， 5]。本研究采用免疫荧光法对150例上呼吸道感染患者鼻、咽、喉部的分泌物标本进行检验， 结果显示， 150例患者病毒感染135例， 病毒感染率为90.00%;其中腺病毒感染38例（28.15%）， 占比最高， 其次流感病毒A为28例（20.74%）、流感病毒B为22例（16.30%）、呼吸道合胞病毒为17例（12.59%）、副流感病毒2为11例（8.15%）、副流感病毒3为11例（8.15%）、副流感病毒1为8例（5.93%）。可见对上呼吸道感染患者的鼻、咽、喉部分泌物标本采用免疫荧光法进行检验， 可快速、准确地检验患者感染率与感染病毒的种类， 效果较为可靠。免疫荧光法使用的试剂是患者的血清与其免疫荧光抗体， 此检验要求试剂要对关键部分抗体有着较高的特异性， 也就是单特异性抗体制剂[5]。近些年来， 随着人工合成免疫原技术的不断发展与进步， 研究发现， 沙门氏菌群的特异性抗原决定簇属于一种双糖， 所以很多研究者首先采用人工合成法对这种双糖进行高浓度地合成， 然后再将其与蛋白质结合， 形成一种免疫原， 最后便可合成群特异性较强的单特异性抗体[7]。近年来新发展而成的单克隆抗体制备技术也为单特异性抗体的制备奠定坚实的基础。 　　免疫荧光法的技术原理是依据抗原抗体反应原理， 把已知抗原或抗体标记上荧光素再制备成一种荧光标记物， 然后使用此类荧光抗体（或抗原）作为分子探针对细胞或组织中相应抗体（或抗原）进行检验[8];由于在细胞或组织内形成的抗原抗体复合物表层含有荧光素成分， 当使用荧光显微镜对标本进行观察时， 荧光素在激发光照射下会发出亮度较大桔红色或黄绿色的荧光， 同时也可观察到荧光所在细胞或组织的具体位置， 进而准确地判断出抗原或抗体的性质、定位， 最后采用定量技术对其含量进行准确地测定[9]。目前， 临床将免疫荧光技术分为荧光抗体法与荧光抗原法两种， 其中应用荧光抗体示踪或检验相应抗原法称为荧光抗体法;应用已知荧光抗原标记物示踪或检验相应抗体法称为荧光抗原法， 前者相对而言较为常用。另外， 临床将应用免疫荧光技术观察与检验细胞、组织中抗原或半抗原物质的方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术， 而免疫荧光细胞化学又分为直接法、间接法、补体法以及夹心法等[10]。本研究应用免疫荧光法检验上呼吸道感染患者鼻、咽、喉部的分泌物标本仅需在实验室2 h内， 并借助荧光显微镜以及相应试剂盒便可检验出150例上呼吸道感染患者的病毒感染率与病毒感染类型， 操作简单、成本低廉， 可在一般实验室内开展， 开展局限性较小。虽本研究结果显示免疫荧光法检验上呼吸道感染患者鼻、咽、喉部分泌物标本的效果较好， 但由于本研究所收集的病例数量较少， 所得研究结果可能会存在一定偏倚， 因此临床还需扩大研究规模进行进一步探究， 且还需对其他微生物感染类疾病采用免疫荧光法进行快速检验， 以验证其检验效果。
　　综上所述， 免疫荧光法可快速检验上呼吸道感染患者病毒感染率与病毒感染种类， 可作为患者疾病进展与预后判断的参考依据， 推荐临床广泛应用。
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　　[收稿日期：2019-09-11]
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