干涉显微细胞相位快速恢复及图像预处理分析

来源:用户上传      作者:钟彩 潘梅森 彭春富 胡常乐

　　摘   要：和传统成像技术相比较，相位显微成像应用期间省略了染色环节，并且能实现无损伤性操作，成像结果可以数量化，近年来在生物细胞学科领域中有较广泛应用。很多学者陆续提出较先进的定量相位成像技术和光波干涉原理存在一定相关性。文章首先阐述了相移干涉显微成像基本原理及典型的相位恢复方法;其次提出新型微分相位提取法;最后对显微镜下细胞图像进行预处理，并以此方法作出模拟及实验验证，目的是阐述相位梯度用于辨识细胞类别及内部结构的可行性。
　　关键词：干涉显微细胞;相位快速恢复;成像技术;图像处理
　　显微技术是研究细胞内部结构与动力学行为的主要手段，过往生命科学研究中长期沿用传统显微镜，适用性偏低的问题逐渐暴露出来，成像技术及方法噬待作出创新。Zernike在20世纪40年代初期首次提出相位成像技术的概念，成功把样品位相结构转型为光结构改变，明显提升了相位物体的可辨识度[1]。伴随研究深度的拓展，更多人员认识到定位测量相位分布情况的必要性。
　　1    相移干涉显微成像
　　1.1  相移干涉原理
　　针对干涉显微的运行机制，可以从光波干涉和显微拓展两个方面予以分析。通过收集明暗相间的干涉图像，在适宜算法的支撑下处理干涉图像，获取和被测物体相位信息相关的资料，实现相位目标。当下可供选择的干涉相位相位技术并不唯一，其中，平面光波在两相干涉光波中应用较为广泛。
　　相移干涉被定义为由差异性的相移量引入至物光臂或参考臂，为采获相应对相移干涉图形创造便利，然后基于被采获图样，有效分离其内储中待测物体的相位排布状况。过往的相移干涉一般会把不同的常数相移按照一定次序引入至参考光，进而获得存在多种改变的干渉图样。可假定在记录平面上参考光的复振幅是[2]：
　　（1）
　　在式（1）中，n代表晌数序列，δn代表第n帧的相移量，综合分析后，可用式（2）表示经物光波与参考光波相干涉后的强度：
　　（2）
　　式（2）是相移干涉的基本表达式。
　　1.2  相移干涉下的典型相位恢复方法
　　（1）最小二乘法：是相移干涉内重现相位信息的常用方法之一，能较为便利地测得干涉图样内的一些未知参数，并确保求得的参数数值和真实值之间误差平方和最小。
　　（2）代数运算解析法：在相移干涉中，通常要求采获的干涉图样数目不低于3个，才可以从根本上保证相位信息的重现效果。对以上操作决策进行分析可知，主要由于在相移已知时，其干涉强度涉及了3个未知数，即：I0（x， y），γ（x， y）与φ（x， y），三步与四步相移干涉应用范围较广。
　　（3）主分量分析方法：属于数学学科领域中的一种降维统计方法，利用一个正交变换把一个已知有關变量转型为不相关的变量。
　　2    新型微分相位恢复方法
　　2.1  基本理念
　　传统微分相位恢复法能在离轴式干涉显微内快捷、高效地提取定量相位信息，得力于在定量成像系统内调整条纹周期短于成像系统的衍射极限，可以不计入样品临近区中诱导的相位改变，即有<<k。但在实际状况下，其相应边界位置折射率存在着较明显的波动，以致相位的改变通常较大。
　　针对以上情况，本文提出了一种新型相位恢复法，与某种条件之间持有较高的契合度，在整体、轻微离轴干涉领域中均表现出较高适用性，具体使用时只需要测算出干涉图样的干涉项、一阶及二阶偏导便能达到相位恢复。
　　2.2  模拟微小球数值及验证方法
　　为强化计算的简洁性，设物光波与参考光波都是单位振幅的平面波。光源波长设为632.8 nm，载波倾斜角是0.025 rad，该小球相位恢复的全过程如图1所示，其中，图1（a）是模拟的小球干涉，规格是512×512像素，观察本土能发现一个圆形区，域该圆形轮廓相对应的为小球沿轴向形成的投影。该区中干涉条纹存有较显著的弯曲，囊括了小球振幅与相位信息[3]。图1（b）是经高通滤波处理后所分离出的干涉项。图1（c）和图1（b）依次是干涉图的横向一、二阶偏导图样，依照主分量分析方法，能较快速获得小球的相位分布，如图1（e）所示。本文使用的小球是均质体，相位和轴向厚度两者存在线性关系，故而能直接由相位分布内解耦厚度，如图1（f）所示。历经系统测算后，模拟计算出的最大厚度值是4.007 1 μm，和理论值相比较偏差0.007 1。由此推测出以上方法应用期间持有较高准确度。
　　2.3  相位梯度形态估算法
　　用数字图像处理内边界检测的思维去设定细胞的边缘，进而大致估算细胞的规格及形态。相位梯度对细胞边缘及折射率改变表现出较高的敏感性，早已被相关学者所论证。对白细胞相位图行横向一阶偏导运算，获得的结果如图2所示。从宏观层面上分析，图2（a—b）呈现出的分别是一个同心球、偏心球模型，图2（c）为一个外球内含有两个大小等同的偏心球模型[4]。能较好地呈现出细胞及细胞核的大小及空间方位，以上也和本研究所构建的理论模型相匹配。故而，相位梯度能为解读细胞内部结构与形态相关工作提供较合理的参考，但需阐述的是，不可以只是从单一方向的相位梯度就百分百确定细胞的形态等参数，主要是因为相位呈现的为生物细胞核周边环境相对折射率差以及细胞厚度两者乘积，而无法清晰呈现出各点对应的具体情况。
　　3    实验研究
　　3.1  基于完全离轴干涉的均质红细胞
　　观察基于衍射相位显微采到的红细胞干涉图像可发现，背景横直条纹密集化，条纹对应的载波频率也相对较大，如图3（a）所示。横直条纹处于水平向，因而可推测平面参考光于y向发生倾斜，此时采用新型微分法运算时，需计算图样在y向上的一阶和二阶偏导。图3呈现了红细胞相位恢复的预算全过程。对比图3（f）与图3（g），发现两者在分布上有一定相似之处，图3（f）内的噪声较大，但该因素并不会影响整个轮廓，对其成因予以分析，主要由于采用的干涉图绝非是试验期间获得初始图像。对该试验结果整体分析后，认为该方法用于实践中在准确性、可执行性方面占据优势[5]。 　　3.2  基于微离轴干涉的皮肤癌细胞
　　微离轴干涉可以被看成是一种介于同轴干与离轴干涉之间的一类干涉模式。通常情况下，在微离轴干涉中，需要采获的相移干涉图为两幅，其目的是解除背景光强，随即采用希尔伯特转化两个干涉图样的差，实现恢复整个相位。图4是微离轴干涉成像系统采集到的一副干涉图，采用本文所建设的新型相位恢复法提取图4癌细胞持有的相位信息。以精确处理图像的思想为支撑，消除背景光强干扰后，能较顺利、精确的获取到干涉项，而后测算干涉图样于y向的一、二阶偏导，建所需的相位分布，如图4（b）所示。图4（c）是基于二步相移干涉下经转化而获得的相位结果。比较图4（b—c）两个相位分布状况，发现两者之间并没有显著差异，结合Shaked在研究中论述的内容，充分地证实该新型微积分用于细胞成像领域中的精确性、稳靠性[6]。
　　4    结语
　　Bhaduri提出的传统微分相位恢复法在使用期间，仅会涉及微分运算，具有运算快速的优势，但对相位变化情况提出较严格的要求。为了提高显微镜下细胞图像研究效果，基于传统方法的相位余数，本文提出了一种新型微分相位恢复法，实验研究表明，该方法不仅在离轴干涉领域中表现出较高的适用性，还适合微离轴干涉，在生物细胞类别辨识领域也有较大的推广价值。经过预处理后，能得到更清晰的细胞图像，有利于后续图像的定位分割研究。
　　[参考文献]
　　[1]司访，曹娜，吕登飞.人与四种实验动物血液图像分析方法综述[J].赤峰学院学报（自然科学版），2018（7）：104-105.
　　[2]張静，蒋莉，张丽芬，等.荧光成像技术自动检测线索细胞的研究[J].广东医科大学学报，2018（3）：256-259.
　　[3]程鸿，吕倩倩，韦穗，等.基于光强传输方程与SLM的快速相位恢复（英文）[J].红外与激光工程，2018（7）：297-301.
　　[4]董健，许志强，孙云霞，等.基于多波束相位恢复的射电望远镜主反射面动态形变的快速测量[J].光学学报，2018（6）：198-205.
　　[5]李聪慧，曹若凡，许夏瑜，等.无透镜显微成像技术在即时检测中的应用进展[J].中国激光，2018（2）：224-233.
　　[6]孔文，高峰，樊金宇，等.线扫描共聚焦成像技术在生物医学成像中的应用[J].激光与光电子学进展，2018（5）：18-26.
　　Rapid phase recovery and image retention analysis of microcells
　　Zhong Cai， Pan Meisen， Peng Chunfu， Hu Changle
　　（Changde  Vocational  Technical  College， Changde 415000， China）
　　Abstract：Compared with the traditional imaging technology， the staining link is omitted during the application of phase microscopic imaging， and the damage-free operation can be realized， and the imaging results can be quantified， which has been widely used in the field of biological cell science in recent years. Many scholars have put forward more advanced quantitative phase imaging technology， many of which have some correlation with the principle of light wave interference. Firstly， the basic principle and typical phase recovery method of phase-shifting interference microscopy are introduced in this paper. Secondly， a new differential phase extraction method is proposed. Finally， it preprocesses the cell image under the microscope， and uses this method to make simulation and experimental verification. The feasibility of using phase gradients to identify cell types and internal structures is described.
　　Key words：intervention microcells; rapid phase recovery; imaging technology; image processing
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