虾青素法夫酵母β-胡萝卜素转化酶的生物信息学分析

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　　摘要：以虾青素中法夫酵母酶氨基酸序列为研究对象，利用ProtParam、SignalP、PSORT、ProtScale、SOMPA、PredictProtein、PROSITE、COILS和SWISS-MODEL等在线预测工具，对其理化性质、亚细胞定位、亲疏水性、二级结构、三级结构等进行分析。结果表明，该转化酶由557个氨基酸残基构成，是一种无信号肽，具有跨膜结构，定位于细胞色素氧化酶中的可溶性亲水蛋白。α螺旋和无规卷曲为主要的二级结构元件。三级结构以PDB ID 5vcc.1的B链为模板，功能预测为细胞色素P450。生物信息学手段分析预测结果可靠性较高，为进一步研究虾青素的生物合成调控机制提供了理论依据。
　　关键词：虾青素;法夫酵母;β-胡萝卜素转化酶;生物信息学
　　中图分类号：S963.73         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）01-0156-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.036           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： The amino acid sequence of the yeast extract of Astaxanthin was used as the research object. The physical and chemical properties and subcellular localization were determined by online prediction tools such as ProtParam， SignalP， PSORT， ProtScale， SOMPA， PredictProtein， PROSITE， COILS and SWISS-MODEL.， pro-hydrophobicity， secondary structure， tertiary structure， etc. were analyzed. The invertase consisted of 557 amino acid residues and was a signal-free peptide， a transmembrane structure， and a soluble hydrophilic protein localized in cytochrome oxidase. The alpha helix and random coil are the primary secondary structural elements. The tertiary structure uses the B-chain of PDB ID 5vcc.1 as a template， and its function is predicted to be cytochrome P450. The bioinformatics method is more reliable in analyzing and predicting the results， which lays a theoretical foundation for further research on the biosynthesis regulation mechanism of astaxanthin.
　　Key words： astaxanthin; phaffia rhodozyma; β-carotene converting enzyme; bioinformatics
　　蝦青素（Astaxanthin）是一种抗氧化性极强的天然类胡萝卜素，具有着色、抗肿瘤、增强免疫力等多种生物学功能，被广泛应用于水产养殖、医药、保健食品等行业中[1]。法夫酵母（Phaffia rhodozyma）是一种重要的天然虾青素资源，其体内的β-胡萝卜素（β-carotene）转化酶（Asy）是目前发现的惟一一个直接参与氧化β-胡萝卜素成为虾青素的酶[2]。在法夫酵母中，乙酰辅酶A经过甲羟戊酸途径转变为异戊烯焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate，IPP），然后通过异构、缩合、脱氢、环化等步骤合成β-胡萝卜素，β-胡萝卜素经羟化和酮化作用后形成虾青素[3]。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　虾青素法夫酵母β-胡萝卜素转化酶氨基酸序列下载自NCBI网站，GenBank登录号为DQ002007.1。
　　1.2  生物信息学分析
　　利用 ProtParam 分析虾青素法夫酵母β-胡萝卜素转化酶的理化性质，SignalP[4]预测信号肽，PSORT预测细胞亚定位，TMHMM进行跨膜结构分析，ProtScale预测亲疏水性[5]，SOMPA预测二级结构[6]，PredictProtein[7]预测二硫键，PROSITE预测功能位点，COILS[8]预测卷曲螺旋，SWISS-MODEL[9-11]进行同源建模。
　　2  结果与分析
　　2.1  Asy的一级结构及理化性质分析
　　ProtParam分析结果显示，Asy由557个氨基酸残基组成（表1），其中比例最高的为Leu（L），占9.9%;比例最低的为Cys（C），占0.5%。Asy的相对分子质量为62630.88，理论等电点（pI）为5.67，其中带负电氨基酸残基Asp（D）和Glu（E）的总数为77个，带正电氨基酸残基Arg（R）和Lys（K）的总数为67个，半衰期大于30 h，不稳定系数41.77，脂肪族指数88.98，总平均亲水性GRAVY为-0.195，为稳定的亲水性蛋白质。 　　2.2  Asy的信號肽、亚细胞定位、跨膜结构域和亲疏水性分析
　　通过SignalP 4.1 Server分析发现，Asy的自然分裂位点分值（C-Score）的峰值为0.130 7（第20位），组合分裂位点分值（Y-Score）的峰值为0.284（第20位），组合分裂位点分值（S-Score）的峰值为0.809（第1位），并不存在信号肽（图1）。TargetP 1.1 Server-prediction results预测Asy在细胞内的定位，mTP为 0.190，SP为0.855，RC为2，说明该蛋白主要分布于细胞质内。
　　PSORT 细胞亚定位预测Asy位于细胞色素氧化酶中。应用 TMHMM Server v.2.0对Asy进行跨膜结构分析（图2），发现该蛋白含有一个跨膜结构域（TMHs），非跨膜螺旋区（ExpAA）为22.831 27  （>18），预测表明该蛋白为跨膜蛋白;蛋白的N端位于膜内侧的概率为0.980 63，说明该蛋白总体位于膜内。通过ProtScale对Asy的氨基酸序列亲疏水性进行在线预测，多肽链中的第7位L的疏水值为2.733，是疏水性最强的氨基酸，第130位K疏水值为-2.878，是亲水性最强的氨基酸。整条肽链中亲水性氨基酸残基数多于疏水性氨基酸残基（图3），可以预测Asy为可溶性亲水蛋白。
　　2.3  Asy的二级结构分析
　　利用SOMPA对Asy的二级结构进行分析预测，发现其二级结构中，α螺旋占45.42%（253个氨基酸残基），延伸链结构占12.03%（67个氨基酸残基），β转角占3.59%（20个氨基酸残基），无规卷曲占38.96%（217个氨基酸残基），可以看出α螺旋和无规卷曲是Asy二级结构的主要构成原件。
　　PredictProtein预测结果表明，Asy中不存在二硫键;PROSITE蛋白质功能位点分析发现，Asy具有G蛋白偶联受体家族1的特征（438-454aa），其氨基酸序列为GTMVMLPLFNINRSKFI。
　　2.4  Asy的卷曲螺旋域分析
　　如图4所示，通过COILS分析，Asy在Window=7、14、21时，卷曲概率均小于0.5，说明Asy不含卷曲螺旋结构。
　　2.5  Asy的三级结构建模及结合位点预测
　　SWISS-MODEL建模以PDB ID 5vcc.1的B链为模板，功能预测为细胞色素p450。模型的总体评价为0.57，Qmean为-3.68（图5）。
　　3  讨论
　　β-胡萝卜素转化酶（Asy）是法夫酵母β-胡萝卜素到虾青素转化过程中发现的惟一一个酶，但是目前国内外对于该酶的研究甚少，其在法夫酵母中的功能、催化机理及其酶学性质等方面都缺乏深入的研究[12]。从生物信息学分析的结果可以看出，Asy整条肽链中亲水性氨基酸残基数多于疏水性氨基酸残基，并且其二级结构中富含α螺旋和无规卷曲，有助于保持蛋白质结构的稳定。Asy是稳定的亲水性蛋白质。Asy中不含二硫键，这可能是由于其Cys残基含量低并且在催化功能中发挥关键作用。蛋白质分子内或分子间的卷曲螺旋结构主要与分子识别、细胞骨架和细胞运动等功能相关，Asy中不含卷曲螺旋结构，也不发挥上述功能。
　　研究发现，Asy是以膜蛋白的形式少量存在于法夫酵母中，Asy同时具备羟化和酮化的功能。从结构上发现Asy的438-454aa区域具有G蛋白耦联受体家族1的特征，G蛋白耦联受体A类为视紫红质样受体，视紫红质是一种由视黄醛和视蛋白结合而成的结合蛋白。通过生物信息学手段对Asy的分析预测结果显示与其实际功能有很强的联系，证明预测结果的可靠性较高。这对于研究法夫酵母β-胡萝卜素到虾青素的转化过程提供了新的思路。
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