‘棉梨’染色体倍性鉴定

来源:用户上传      作者:李春兰　牛莹莹　吴玉霞　周奥特　宋金龙　曾甜　何天明

　　 摘要：以‘库尔勒香梨’、‘黑酸梨’、‘沙梨01号’为对照，利用流式细胞仪和根尖压片法对‘棉梨’的染色体倍性进行鉴定，以期为梨种质资源的创新和利用提供参考。结果表明：根尖压片得出‘库尔勒香梨’、‘黑酸梨’、‘沙梨01号’以及‘棉梨’的染色体数目分别为34、51、68以及34，‘棉梨’的染色體数目与二倍体的‘库尔勒香梨’相同;利用流式细胞仪得出‘库尔勒香梨’、‘黑酸梨’、‘沙梨01号’以及‘棉梨’均出现了一个峰，且峰值比为1.0∶1.5∶2.0∶1.0，即各梨品种叶片细胞中DNA相对含量为 2C∶3C∶4C∶2C。综上可得：‘棉梨’的染色体数目为2n=2X=34，为单纯的二倍体。
　　关键词：棉梨;流式细胞仪;染色体倍性;根尖压片法
　　中图分类号：S661.201 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2020）05-0016-05
　　Abstract With pear varieties Korla Fragrant Pear， Heisuanli and Shali 01 as internal reference standards， the ploidy of Mianli （Pyrus sinkiangensis） was identified by flow cytometry and root-tip squashing methods. The objective was to provide references for the innovation and utilization of pear germplasm resources. The results showed that the chromosome numbers of Korla Fragrant Pear， Heisuanli， Shali 01 and Mianli were 34， 51， 68 and 34， and the chromosome number of Mianli was the same as that of Korla Fragrant Pear. In addition， one peak was obtained in Korla Fragrant Pear， Heisuanli， Shali 01 and Mianli by flow cytometry， and the peak ratio was 1.0∶1.5∶2.0∶1.0， that was， the relative DNA content in the leaf cells of each pear variety was 2C∶3C∶4C∶2C. In conclusion， the chromosome number of Mianli was 2n=2x=34， a simple diploid.
　　Keywords Mianli; Flow cytometry; Chromosome ploidy; Root-tip squashing method
　　 新疆是我国重要的梨产区，也是世界梨种质资源的富集区[1]，拥有许多珍贵的梨种质资源，如闻名中外的商业化栽培良种‘库尔勒香梨’[2]，罕见的三倍体梨品种‘杏叶梨’（Pyrus armeniacaefolia）[3]和具雄性不育特性的有性杂交新品种‘新梨7号’[4]。另外，新疆境内广泛分布的新疆梨（Pyrus sinkiangensis Yu）品种群分属我国五大栽培梨系统之一[2]。
　　 近年，本课题组在新疆梨普查中发现了具单性结实特性的新种质——‘棉梨’，初步的田间授粉试验表明该品种具无融合生殖特性。具无融合生殖特性的种质可产生与母本基因型相同的无性种子，作为优良砧木利用潜力巨大，前景广阔，所以对‘棉梨’这一特殊的生殖特征进行深入研究十分必要。然而，学术界对梨无融合生殖研究甚少，仅见前苏联学者的一篇报道[5]。但人们对苹果属植物的无融合生殖研究已较为深入，这无疑对同为蔷薇科的梨属植物无融合生殖研究颇具参考价值[6-8]。在苹果属中，具无融合生殖的皆为多倍体野生种[9]。许多学者认为，植物的无融合生殖与其多倍性相关[10，11]。所以，要探究‘棉梨’无融合生殖遗传特性，先行鉴定其染色体倍性是很有必要的。
　　 植物倍性鉴定是倍性育种及其应用的重要一环，如何简便、准确地鉴定出植株倍性水平，从而大大减少育种的工作量及盲目性，降低成本，加速育种进程，在农作物倍性育种中具有重要意义。目前，最常用的植物倍性鉴定方法仍是分子水平的鉴定和直接染色体计数，即流式细胞计数法和常规压片法。染色体计数是传统的、最直接的确定植物倍性的方法[12]，此法能直观鲜明地观察染色体形态和数量，但对于染色体小且数目较多的属下种而言，染色体计数较为困难，需借助其他方法[13]。20世纪80年代以来，流式细胞仪问世，以能够快速鉴定植物的染色体倍性水平，特别适用于样品较多时的倍性检测分析[14]，不受植物取材部位和细胞所处时期限制，而且可以直接观测嵌合体和混倍体图像等优势，很快在植物遗传和育种中得到了广泛应用，但其缺点是无法直接观测到染色体的数量及形态特征[15]。鉴于此，本研究将流式细胞仪检测法与根尖压片法相结合，以倍性已知的新疆梨二倍体品种‘库尔勒香梨’[16]、四倍体品种‘沙梨01号’[17-19]和三倍体品种‘黑酸梨’[20]为内参，对‘棉梨’的染色体倍性进行了系统研究， 旨在为今后探讨‘棉梨’无融合生殖的遗传机制和鉴定杂交后代倍性提供必要的技术支持和本底资料。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　 本研究于2017—2019年在新疆农业大学果树生物学研究中心完成。供试梨种质为‘棉梨’、二倍体‘库尔勒香梨’、三倍体‘黑酸梨’、四倍体‘沙梨01号’，选取其经种子培育而成的实生苗及新疆轮台国家果树资源圃保存的20年生成龄梨树种子，用流式细胞仪和根尖压片法测定染色体倍数。供试品种的砧木均为杜梨，果园管理水平中等。 　　1.2 试验方法
　　1.2.1 根尖细胞染色体制片 参照刘敏[21]和孙琪[22]等的方法稍作修改：采集成熟、饱满的供试品种种子，在温水中浸泡过夜，剥去种皮，于200 mg/L GA3溶液中浸泡24 h后，用蒸馏水冲洗干净，置于放有湿润滤紙及纱布的培养皿中，25℃培养。待根尖生长至0.5～1.5 cm时，切取根尖前端0.5 cm，投入0.002 mol/L 8-羟基喹啉溶液中4℃预处理6 h。用蒸馏水对已完成预处理的材料进行2～3次冲洗，并放入卡诺固定液[甲醇∶冰醋酸=3∶1（V/V）]中，于4℃固定24 h。之后，在1 mol/L HCl溶液中60℃恒温下解离15 min。吸除HCl溶液，用蒸馏水洗2～3次，然后在蒸馏水中室温低渗30 min。卡宝品红染色30 min，切下根尖前端2 mm置于载玻片上，滴一滴蒸馏水后轻轻盖上盖玻片，用铅笔的橡皮端轻敲盖玻片，以确保细胞及染色体可以较为均匀地散开。成片在Nikon ECLIPSE 80i 显微镜的100×油镜下观察，用NIS-Elements F3.0软件拍照。各品种选取5个分裂相良好的根尖，每个根尖选取2～3个染色体分散良好的细胞，统计染色体数目。
　　1.2.2 流式细胞仪检测 选择适合梨细胞核分离提取的缓冲液WPB[23]：0.2 mol/L Tris-HCl，4 mmol/L MgCl2· 6H2O，2 mmol/L EDTA· Na2· 2H2O，86 mmol/L NaCl，10 mmol/L焦亚硫酸钠，1% PVP-10，1%（V/V）Triton X-100，pH=7.5，4℃下分装保存。PI染液配制方法参考弓娜等[24]的方法。
　　 供流式细胞仪检测的样品悬浮液制备参照Galbraith[25]、Isuzugawa[26]和弓娜等[24]的方法稍作修改：春季取各试验品种幼嫩叶片（约1 g），蒸馏水洗净表面尘土，滤纸吸干后放入预冷的培养皿里，加入预冷的解离液（约1～2 mL），用锋利的刀片一次性快速切碎，整个过程，材料须浸没在解离液里1 min，以便更好地游离细胞核。吸取培养皿内的解离液，用400目的滤膜过滤到1.5 mL离心管中以去除残片。然后置于4℃冰箱中，孵育5 min。4℃、1 000 r/min离心5 min。弃上清后，再加入100 μL预冷的解离液，同时加入150 μL预冷的染料，每个样制得约250 μL细胞核悬浮液。然后置4℃冰箱，避光，染色10 min。移至上样管，上机检测，收集5 000个颗粒。各样品重复3次。流式细胞仪测定结果使用Cytometer Software Workspace软件收集DNA含量和进行倍性分析，得出直方图。
　　2 结果与分析
　　2.1 ‘棉梨’根尖染色体数目观察
　　 对照品种‘库尔勒香梨’根尖体细胞染色体数目为2n=2X=34，二倍体（图1-1）;‘棉梨’实生苗根尖细胞染色体数目为34（图1-2）;‘黑酸梨’染色体数目为2n=3X=51，三倍体（图1-3）;‘沙梨01号’的染色体数目为2n=4X=68，四倍体（图1-4）。‘棉梨’与二倍体对照‘库尔勒香梨’的染色体数完全一致，因此推断‘棉梨’也为二倍体，染色体倍性为2n=2X=34。
　　
　　 2.2 流式细胞仪对‘棉梨’叶片细胞染色体倍性的检测
　　 利用流式细胞仪对3个对照种质的染色体倍性进行荧光检测，结果如图2，可以看出，二倍体种质‘库尔勒香梨’的倍性荧光检测结果为单峰，峰值出现的荧光强度在1.0×105左右，且其体细胞DNA含量可确定为 2C， （C表示单倍体核的DNA含量），即二倍体种质相对应的荧光强度约为 1.0×105 左右。对三倍体种质‘黑酸梨’和四倍体种质‘沙梨01号’进行倍性荧光检测时也得到一个峰，峰值时的荧光强度分别为1.5×105和2.0×105，分别是‘库尔勒香梨’的1.5倍和2.0倍，且峰对应的种质DNA含量分别为3C和 4C，其对应种质的细胞倍性分别是三倍体和四倍体，与已知‘黑酸梨’和‘沙梨01号’分别是三倍体和四倍体品种相对应。
　　 由图3可见，‘棉梨’叶片细胞染色体倍性的荧光检测结果也为单峰，峰值所在的荧光强度为1.0×105，与‘库尔勒香梨’的峰值基本重合。
　　 综上可知，‘棉梨’、‘库尔勒香梨’、‘黑酸梨’和‘沙梨01号’峰值出现相对应的PI荧光强度比为1.0∶1.0∶1.5∶2.0，即4个种质的叶片细胞C值水平分别为2C、2C、3C和4C，分别为二倍体、二倍体、三倍体和四倍体。
　　3 讨论
　　3.1 ‘棉梨’染色体倍性
　　 本研究通过根尖压片和流式细胞仪结合的方法，以已知的三种不同倍性的梨品种为参照，首次对‘棉梨’这一特殊种质的染色体倍性进行了鉴定。两种方法得出同一结论：‘棉梨’为二倍体梨品种，其染色体倍性为2n=2X=34。我们在前期的田间授粉试验和胚囊发育研究中发现‘棉梨’有兼性无融合生殖的特性。‘棉梨’作为一种二倍体梨属植物，大孢子母细胞分裂和染色体倍性变化规律是揭示其无性胚囊形成机制的关键，这尚属一个新的研究领域。虽然Siena等[27]在双穗雀稗（Pasplum rufum）中首次发现具有无融合生殖能力的二倍体，但在苹果属育种实践中很难创制出二倍体无融合生殖类型[28-30]。‘棉梨’作为苹果属的同科植物，以二倍体的身份表现出兼性无融合生殖特性的事实似乎隐含着迥异于苹果属植物的无融合生殖遗传机制，这将是我们下一步深入研究的内容。
　　3.2 梨属植物染色体倍性鉴定方法
　　 植物染色体倍性鉴定早期以压片法为主，去壁低渗 Giemsa 染色法后来居上，流式细胞仪在梨属植物染色体倍性鉴定中的应用只是近30年的事[31]。染色体计数是确定植物倍性最可靠的方法，此法可观察染色体形态和数量，直观鲜明，但对于染色体小且数目较多的属下种而言，观察技术难度较大，往往耗时较长[13]。 　　 流式细胞仪分析法作为一种生物染色体间接鉴定方法，可检测植物嵌合体或混倍体的存在，缺点是无法直接观测到染色体的数量和形态[13，32]。如田路明等[20]以叶片为材料，运用流式细胞仪测得的结果是‘沙梨01号’为二倍体与四倍体的嵌合体;而黄礼森等[17]以根尖为材料用去璧低渗法鉴定出‘沙梨01号’是纯四倍体， Lin 和 Fang[18]也用同法鉴定出‘沙梨01号’是纯四倍体。本研究用压片法和流式细胞仪相结合也鉴定出‘沙梨01号’为纯四倍体。但‘沙梨01号’是否存在二倍体与四倍体嵌合的现象尚待确证。在本试验中，‘沙梨01号’仅作为四倍体梨的内参标样，其倍性争议对靶标二倍体品种‘棉梨’的倍性鉴定结果并无实质性影响，但作为一个有争议的四倍体，对其染色体倍性进行深入研究很有必要。
　　 用流式细胞仪测得‘黑酸梨’与二倍体‘库尔勒香梨’峰值比为1.5∶1.0，即‘黑酸梨’叶片细胞C值水平为3C，用根尖压片法观测得出‘黑酸梨’染色体数目为51，两种方法均得出其细胞倍性为三倍体。这与田路明等[20]以叶片为材料用流式细胞仪检测出‘黑酸梨’为三倍体的结果一致。
　　4 结论
　　 本研究以具有代表性倍性值的新疆地方梨品种‘库尔勒香梨’、‘黑酸梨’、‘沙梨01号’为对照，利用流式细胞仪和根尖压片法对具有特殊生殖方式的‘棉梨’进行染色体倍性鉴定，其结果一致，均显示‘棉梨’染色体数为34，是单纯的二倍体，不存在嵌合体等特别的存在。综合得出：‘棉梨’染色体数目为2n=2X=34，二倍体。在今后的研究中，我们将以此为标准，快速检测‘棉梨’自然杂交后代和人工杂交后代染色体的倍性，以进一步探讨‘棉梨’无融合生殖的遗传学特性。
　　
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