橡胶树种质资源的倍性鉴定

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　　摘  要：倍性鉴定是橡胶树种质资源鉴定评价的基础工作之一。本研究利用流式细胞仪对国家橡胶树种质资源圃内的橡胶树种质资源进行全面的倍性鉴定，对嵌合体的四倍体细胞比例进行分析，并比较不同倍性的气孔性状差异。从5177份野生种质中发现三倍体11份，四倍体1份。从552份魏克汉种质中发现，三倍体9份，四倍体2份，嵌合体14份。14份嵌合体的四倍体细胞比例在49.06%～78.26%之间。不同倍性间的气孔长度、宽度和密度差异均极显著，气孔长度和宽度的排序为四倍体>三倍体>嵌合体，气孔密度的排序相反。研究结果对利用四倍体种质资源开展橡胶树倍性间杂交育种具有重要应用价值。
　　关键词：橡胶树;种质资源;多倍体;流式细胞仪;气孔性状
　　中图分类号：Q949.748.5      文献标识码：A
　　Ploidy Identification of Germplasm Resources in Hevea brasiliensis （Willd. ex A. Juss.） Müll. Arg.
　　ZHANG Yuanyuan1，2，3，4，5， PU Shouqin6，7*， HU Yanshi1，2，3，4，5， FANG Jialin1，2，3，4，5， HUANG Xiao1，2，3，4，5，
　　LI Weiguo1，2，3，4，5**， HUANG Huasun1，2，3，4，5
　　1. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2. State Centre for Rubber Breeding， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Rubber Tree Germplasm Repository， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 4. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 5. State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China; 6. College of Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 7. Engineering Research Center of Rare and Precious Tree Species in Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China
　　Abstract： Ploidy of rubber tree germplasm in the Rubber Tree Germplasm Repository and the ratio of tetraploid cells in chimeras were analyzed by flow cytometry， and the stomatal traits of different ploidy were analyzed. Eleven triploids and one tetraploid were found from 5177 1981’IRRDB germplasms， nine triploids and two tetraploid and fourteen chimeras were found from 552 Wickham germplasms. The ratio of tetraploid cells in fourteen chimeras ranged from 49.06% to 78.26%. The difference of stomatal length， stomatal width， and stomatal density between different ploidy was significant （P<0.01）， the rank of stomatal length and stomatal width was tetraploid>triploid>chimeras， while the stomatal density was reversed. This study was valuable for the use of tetraploid germplasm resources for cross breeding between the ploidy of rubber trees.
　　Keywords： Hevea brasiliensis; germplasm resources; polyploid; flow cytometry; stomatal traits
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.006
　　橡膠树原生于南美洲亚马逊热带雨林地区，属大戟科（Euphorbiaceae）橡胶属（Hevea）植物。自19世纪80年代引种到东南亚地区以来，经过育种家不断地选择育种，产量从初生代无性系的300～400 kg/（hm2·a）增长到如今的2000～ 3500 kg/（hm2·a） [1]。长期的选择育种导致当前橡胶树的遗传基础极为狭窄[2]，限制了更高产优良新品种的选育。多倍体育种与常规育种相比，除利用杂交产生的杂合效应外，还能利用染色体加倍产生的基因剂量效应[3-4]，是解决当前橡胶树育种困境的有效途径之一。20世纪90年代，云南省热带作物科学研究所从GT1×PR107自然杂交后代中选育出高产抗寒新品种云研77-2和云研77-4，并在随后被鉴定为三倍体[5-6]，表明橡胶树多倍体育种是一条有效途径。 　　获得多倍体材料是开展多倍体育种研究的基础。胡东琼等[7]于1982年报道从GT1子代中鉴定出了3株自然三倍体。刘阳平[8]于1983年报道发现了1株自然三倍体。张源源等[9-10]在橡胶树GT1子代中鉴定出大量三倍体植株，为定向开展橡胶树三倍体选育种提供了材料基础。除自然多倍体筛选外，国内外开展了大量人工诱导多倍体的研究，通过秋水仙碱处理生长点和离体组织诱导四倍体、处理花器官诱导有性三倍体等方法，均获得了多倍体植株[11]。
　　国家橡胶树种质资源圃保存着国内规模最大、最完整的橡胶树种质资源材料，主要分为魏克汉（Wickham）种质和1981’IRRDB野生种质两部分。魏克汉种质是指1876年由英国人魏克汉在亚马逊河下游与塔帕若斯（Tapajos）河汇合处的博因（Boim）采集并培育的46 株母树及其繁育的后代，是目前橡胶树栽培品种的主要来源[12]。1981’IRRDB野生种质为国际橡胶研究和发展组织（International Rubber Research and Development Board， IRRDB）于1981年组织的多国联合考察队重返亚马逊热带雨林采集的野生种质资源[13]。本研究通过流式细胞术，对保存于国家橡胶树种质资源圃内的魏克汉种质和野生种质进行全面的倍性鉴定，以期了解橡胶树多倍体收集和保存情况，挖掘多倍体资源，为橡胶树种质资源的创新利用和橡胶树多倍体育种提供基础。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　试验材料取自国家橡胶树种质资源圃，资源圃位于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场九队。其中魏克汉种质552份，1981’IRRDB野生种质5177份。每份种质种植3株，芽接苗，株行距为1.5 m×1.5 m。
　　1.2  方法
　　1.2.1  倍性检测  植株倍性分析在Sysmex CyFlow?Cube8 流式细胞仪上进行。分析方法参考仪器附送试剂使用方法（http：//www.sysmex-partec. com），即取200 mg新鲜叶片置于塑料培养皿中，添加0.5 mL裂解缓冲液，用刀片快速切碎，30 μm孔径滤网过滤，添加1.6 mL DAPI染色体液，室温静置30 s后上机检测。每份种质随机取其中1株的叶片进行检测，检测为多倍体的种质则重检所有植株确认。已知二倍体作为对照。
　　1.2.2  嵌合体不同倍性细胞比例分析  嵌合体不同倍性细胞比例分析样品处理方法同上，每个样品检测颗粒数不少于5000个，检测数据在FCS Express 6 plus中进行数据处理，采用细胞周期分析模型计算不同倍性细胞的颗粒数。每份种质重复检测分析3次。
　　1.2.3  气孔性状观察  观察测量多倍体和嵌合体种质的气孔长度、宽度和气孔密度。对鉴定出的多倍体和嵌合体种质的3株重复，每株取三出复叶的中间叶片3片，采用指甲油法[14]制作气孔观察装片，在Leica DMBL显微镜40×物镜下观察，每片叶随机选3个视野，用Leica DFC550显微镜相机拍照。每个视野中随机取3个气孔，使用ImageJ图像分析软件测量气孔长度和宽度，根据照片长宽的像素数和实际拍摄区域长宽换算成实际长度，每份种质共测量27个气孔的长度和宽度。通过照片气孔数量和照片所拍摄区域的面积计算气孔密度，每份种质获得9个气孔密度数据。
　　1.3  数据处理
　　采用Excel 2016软件进行数据整理和百分数反正弦转换，利用IBM SPSS Statistics 22中文版软件进行方差分析和多重比较。
　　2  结果与分析
　　2.1  流式细胞倍性检测
　　流式细胞倍性检测结果如图1所示，二倍体的DNA相对含量为100（图1A），三倍体植株为150（图1B），四倍体植株为200（图1C），嵌合体则在100和200位置均有波峰（图1D）。
　　种质倍性鉴定统计结果见表1，从552份魏克汉种质中检测出三倍体9份，占比为1.63%，四倍体2份，占比为0.36%，嵌合体14份，占比为2.54%。从5177份1981’IRRDB野生种质中鉴定出三倍体11份，占比为0.21%，四倍体1份，占比为0.02%。多倍体种质名单见表2。
　　2.2  嵌合體细胞倍性分析
　　魏克汉种质中的14份嵌合体均为人工诱导
　　的多倍体，当时被认为是稳定的四倍体，但在本研究中被鉴定为嵌合体。本研究通过流式细胞仪对嵌合体四倍体细胞的比例进行分析（图2和图3），结果表明，14份嵌合体的四倍体细胞比例在49.06%～78.26%之间，种质间差异极显著。多重比较表明四倍体细胞比例最高的是红星1多，比例最低的是PR107多。
　　2.3  多倍体气孔性状分析
　　橡胶树嵌合体、三倍体和四倍体的气孔性状
　　分析结果表明（图3和图4），不同倍性间的气孔长度、宽度和密度差异均极显著（P<0.01）。嵌合体、三倍体和四倍体的气孔长度分别为13.31～ 22.12、14.06～27.41、16.48～27.90 μm，气孔宽度分别为7.53～14.44、9.14～16.72、7.85～7.23 μm，气孔密度分别为442.67～822.11、274.04～855.35、231.88～358.35 mm2。气孔长度和宽度的排序为四倍体>三倍体>嵌合体，气孔密度的排序相反。气孔长度和宽度间相关性系数为0.56，气孔长度和气孔密度间相关系数为0.72，气孔宽度和气孔密度间相关系数为0.52，相关性均极显著（P< 0.01）。嵌合体中四倍体细胞的比例与气孔长度、宽度和密度之间相关性均不显著。 　　3  讨论
　　流式细胞术是大规模检测植物倍性的有效手段，具有快速、准确等优点，已在多种植物的种质资源倍性鉴定中得到应用[15-18]。本研究利用流式细胞仪对5729份橡胶树魏克汉和1981’IRRDB野生种质资源的倍性进行检测，在魏克汉种质中鉴定出多个三倍体、四倍体和嵌合体，并首次在野生种质资源中发现了三倍体和四倍体，表明在亚马逊热带雨林中存在天然橡胶树多倍体。植物三倍体的产生有两种途径：（1）二倍体产生的未减数配子（2n）和减数配子（n）融合;（2）
　　四倍体产生的减数配子（2n）和二倍体产生的n配子融合。植物四倍体的产生同样有2种途径：（1）二倍体产生的未减数雌配子（2n）和未减数雄配子（2n）融合;（2）二倍体经体细胞加倍后发育成植株。未减数配子是植物多倍体产生的主要途径[9-10]，而在橡胶树魏克汉种质中已发现自然产生未减数配子的无性系，并获得了三倍体[19-20]和四倍体（待发表）子代，推测橡胶树野生三倍体和四倍体有为2n配子融合产生的可能性较高，具体有待进一步研究。
　　前人在20世纪8090年代，通过秋水仙碱处理橡胶树的生长点和离体组织等方法获得了大量多倍体[7-8， 21-26]，这些多倍体植株中四倍体细胞比例在60%～100%之间。虽称之为多倍体，但多数实为嵌合体，部分嵌合体长期保存在橡胶树种质资源圃内。本研究通过流式细胞术检测表明，嵌合体植株可经过截干复幼而长期保存，但四倍体细胞的比例略有下降。这些嵌合体的外部形态同四倍体相似，均有叶片宽大、叶色深绿、叶片加厚等特点，通过外部形态难以区分。此外，在野生种质四倍体的3株重复中发现其中1株为嵌合体，推测为四倍体接穗和二倍体砧木共同发育形成，具体有待进一步研究。
　　气孔长度和宽度增大、密度降低是植物多倍体的特征之一[27-28]。橡胶树多倍体的气孔性状差异亦有研究，周钟毓等[29]比较了人工活体诱导获得的橡胶树多倍体的气孔性状，发现多倍体的气孔长度、宽度比二倍体植株大10%，气孔密度小10%。张源源等[30]比较了橡胶树二、三、四倍体的气孔性状差异，发现随着倍性的提高，气孔的长度和宽度均增大，气孔密度变小。本研究结果与之前研究相似，并发现嵌合体的气孔长度和宽度小于三倍体，密度大于三倍体。
　　本研究对橡膠树种质资源进行全面的倍性鉴定，发掘出多份橡胶树多倍体种质资源，补充和完善了橡胶树种质资源数据库，为开展橡胶树多倍体育种研究提供了材料基础。
　　参考文献
　　Omokhafe K O， Nasiru I. Genetic improvement of Hevea brasiliensis in Nigeria[C]//Mathew N M， Jacob C K， Nair M G S， et al. eds. Proceedings of the International Natural Rubber Conference， Cochin， India， 2005： 13-17.
　　吴春太， 李维国， 高新生， 等. 我国橡胶树育种面临的问题与对策[J]. 江西农业学报， 2009， 21（12）： 74-77.
　　Adams K L， Wendel J F. Polyploidy and genome evolution in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005， 8（2）： 135-141.
　　Luca C. The advantages and disadvantages of being polyploid[J]. Nature Reviews Genetics， 2005， 6（11）： 836-846.
　　敖硕昌， 和丽岗， 肖桂秀， 等. 橡胶树高产抗寒材料云研77-2、云研77-4的选育[J]. 云南热作科技， 1998， 21（2）： 3-8.
　　李惠波， 周堂英， 宁连云， 等. 橡胶树新品种云研77-2和云研77-4的细胞学鉴定及育种过程[J]. 热带亚热带植物学报， 2009， 17（6）： 602-605.
　　胡东琼， 梁茂寰， 吴云通， 等. 橡胶树自然多倍体的选择及分离的研究初报[J]. 热带作物研究， 1982（3）： 1-6.
　　刘阳平. 诱导橡胶树多倍体研究[J]. 福建热作科技， 1983（3）： 12-16.
　　张源源， 黄  肖， 李维国. 温度对橡胶树GT1的2n雌配子发生频率的影响[J]. 西南农业学报， 2017， 30（12）： 2634-2638.
　　Zhang Y Y， Zhang X F， Huang X， et al. Low temperature increases the frequency of 2n female gametes in the diploid rubber tree （Hevea brasiliensis （Willd. ex A. Juss.） Müll. Arg.） [J]. Tree Genetics & Genomes， 2019， 15（2）： 23.
　　张源源， 康向阳， 李维国. 橡胶树多倍体诱导机制和途径[J]. 热带农业科学， 2014， 34（5）： 44-49， 58.
　　Clément-Demange A， Priyadarshan P M， Tran Thi Thuy Hoa， et al. Hevea rubber breeding and genetics[M]//Plant Breeding Reviews， Volume 29. USA： John Wiley 8 Sons， Inc.， 2007： 177-279. 　　Annamma V Y. Germplasm resources and genetic improvement[M]//Sehuraj M R， Mathew N M， eds. Natural rubber： biology， cultivation and technology. New York： Elsevier， 1992： 88-115.
　　樓柏丹， 姚  岚. 几种观察植物表皮气孔方法的比较[J]. 生物学教学， 2015， 40（9）： 42-43.
　　白凤莹， 曾青青， 康  宁， 等. 毛白杨基因库优树倍性检测及性状对比分析[J]. 北京林业大学学报， 2015， 37（4）： 113-119.
　　黎月娟， 邱长玉， 林  强， 等. 90份广西桑树种质资源的染色体倍性鉴定[J]. 中国蚕业， 2018， 39（3）： 9-13.
　　刘琰玮， 李美育， 朱景乐， 等. 枣树多倍体种质资源的发掘及其SSR鉴定[J]. 分子植物育种， 2018， 16（10）： 3395-3400.
　　田路明， 齐  丹， 曹玉芬， 等. 利用流式细胞仪鉴定梨种质资源染色体倍性[J]. 中国果树， 2018（3）： 29-32.
　　Bretagnolle F， Thompson D J. Gametes with the somatic chromosome number： mechanisms of their formation and role in the evolution of autopolyploid plants[J]. New Phytologist， 1995， 129（1）： 1-22.
　　Ramsey J， Schemske D W. Pathways， mechanisms， and rates of polyploid formation in flowering plants[J]. Annual Review of Ecology， Evolution， and Systematics， 1998， 29： 467-501.
　　郑学勤， 曾宪松， 陈向民， 等. 诱导橡胶多倍体与其细胞学研究续报I[J]. 热带作物学报， 1980， 1（1）： 27-31， 108- 109.
　　郑学勤， 曾宪松， 陈向民， 等. 诱导橡胶多倍体及其细胞学研究续报Ⅱ[J]. 热带作物学报， 1981， 2（1）： 1-9， 129- 130.
　　郑学勤， 曾宪松， 陈向民， 等. 几个高产和抗性无性系多倍体的研究[J]. 热带作物研究， 1983（1）： 5-7.
　　陆永林， 李渭廉， 冯雪原. 橡胶树多倍体开花习性及生
　　殖器官形态的初步观察[J]. 热带作物学报， 1984， 5（1）： 1-7， 111.
　　凌绪柏， 陈广盛. 利用古铜期嫩叶鉴定橡胶树人工多倍体及其分离技术的研究[J]. 热带作物学报， 1988， 9（2）： 11-16， 110.
　　凌绪柏， 陈广盛， 杨廷元. 提高橡胶树多倍体诱导率的方法研究[J]. 热带作物学报， 1988， 9（2）： 1-9， 109.
　　李  赟， 石荫坪， 束怀瑞， 等. 应用气孔性状对苹果与梨的倍性判别分析[J]. 果树科学， 1999， 6（1）： 9-13.
　　巢  阳， 周  燕. 通过测量叶片气孔鉴定月季染色体倍性的研究[J]. 北京农学院学报， 2015， 30（3）： 79-85.
　　周钟毓， 詹赛荣， 陈传琴， 等. 巴西橡胶树多倍体植株的气孔特征[J]. 热带作物研究， 1989， 9（4）： 4-8.
　　张源源， 郭  涵， 袁红章， 等. 橡胶树不同倍性的气孔性状差异研究[J]. 热带作物学报， 2017， 38（3）： 389-394.
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