大别山区茶树种质资源多样性的ISSR分析
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摘 要 大别山区茶树栽培历史悠久，有着丰富的茶树种质资源，对茶树的品种选育和生物技术的研究有着很大的作用。最近几年已经发展日益成熟的ISSR简单重复序列间隔区技术，已经能够从DNA反应出来的水平展示出各个材料之间的差别和遗传特点，这个方法技术已经成为研究生物遗传多样性的非常有利的工具，并且方法简单，使用方便快捷。本文以舒城县舒茶镇九一六茶园为实验材料进行茶树种质多样性的ISSR分析。此次研究可为大别山区茶树的持续发展利用以及生物多样性的保护提供部分参考依据。
关键词 大别山区 茶树 种质资源 ISSR 多样性分析
中图分类号：S567 文献标识码：A
0引言
茶树的种质资源是自然进化的产物，它在生长进化过程中由于各种外界和内部的因素产生了很多的遗传变异，而这些遗传基因中包含着许多决定它们各种特征的基因。而茶树进行育种的主要基础是茶树的种质资源，茶树育种是对茶树种质资源的基因选择，并且利用优质种质资源对茶树进行育种。当前世界各地的产茶国对茶树种质资源的采集和改进是十分关注的，茶叶市场的不断发展和茶叶的科技创新是离不开茶树种质资源的开发利用的。
1大别山茶树种质资源多样性的ISSR分析
1.1供试材料样本的收集
实验材料采自舒城县舒茶镇九一六茶园，共计20份茶树种质资源，从所选取的20份茶树种质资源中采取其较嫩的新梢叶片，采用硅胶干燥法收集样品，并于-20℃冰箱保存，然后用于基因组DNA的提取。
1.2供试材料DNA的提取
实验前对仪器进行提前灭菌，实验过程中对操作仪器应该轻拿轻放，避免因为剧烈的震动而对实验造成影响。采用改良CTAB法提取收集到的20份样本基因组DNA，其操作方法为：（1）将CATA缓冲液置于65℃水浴预热，同时开始制冰。（2）称取0.5g处理后的茶树叶片，进行研磨，形成茶粉。（3）取0.1g研磨后的茶粉加入EP试管中，加入1ml预冷的TE清洗液和10ul巯基乙醇，进行冰浴。（4）取出EP管进行离心实验。（5）取出EP管，将上清液进行吸取转移到另外一个新的EP试管中，加入2ml无水乙醇，混匀后静置，让核酸沉淀。（6）把絮状沉淀物挑入加入800ul的75%乙醇的1.5ulEP中，进行洗涤沉淀操作，在室温环境下使DNA沉淀干燥。（7）使得到的DNA沉淀在50ul的ddH2O中，在-20℃中保存。（8）设置空白参照，取样品1ul置于蛋白核酸检测仪针头上检测，得出检测结果。
通过CTAB法提取20份样本的基因组DNA，根据得出的电泳图可以得知OD260/OD28的值处于1.8和2.0之间，表明此次实验所采用的材料和方法提取的茶叶种质资源DNA的效果比较好，得到的DNA的浓度、纯度都比较高。
1.3 ISSR对茶树遗传多样性和亲缘关系的分析
在20份茶树DNA提取的基础上，用扩增产物多态性好、稳定性高的ISSR引物用于样本DNA扩增。
根据20中茶树种质资源的ISSR聚类分析图谱，可以得知：供試材料间的遗传相似系数GS值在0.589～0.774之间。其中，舒城大叶种和舒城药茶的GS值为0.778，二者的遗传关系最为相近。而GS值最小的是平阳特旱和日本群体种，GS值是0.589，表示平阳特旱和日本群体种的亲缘关系最远。根据遗传相似系数按UPGMA方法进行聚类，当遗传距离为0.730时，可以将20份茶树种质资源分为五大类。其中，D类还有12个茶树种质资源，占实验材料中所有种质资源的60%，表明舒城县其特有的茶叶种质资源有着独特的遗传基因。
对大别山区茶树种质资源20分样本进行扩增，共得到了36个位点，多态性比率是95.2%，扩增条带的大小介于250～1800kb之间。以最具代表性的舒城大叶种为中心，按照方位组建的四个方位群居中，多态性位点最多的是东北群落，而最少的是西南群落。四个方位的群落中在群内发生遗传变异的概率比较大。在众多ISSR标记位点处，基因流的平均值为1.6223，仅仅能够抵质遗传漂变引起的基因变异。各种茶树种质资源在一定程度上具有一定的亲缘关系，它们的基因相似性是基于它们的亲缘关系，舒城大叶种、舒城药茶和平阳特旱种质资源遗传多样性比较丰富，并且在DNA的遗传上具有很好的稳定性。
2结语
对茶树种质资源多样性的分析使用DNA分子标记法是非常可行的，因为DNA在遗传上具有稳定性，而茶树的一些特征受到环境因素的影响是比较大的，因此，对茶树种质资源的多样性分析，ISSR分析方法能够更好地研究其种质资源的遗传多样性，并且能有效的鉴别出不同种类的茶叶种质资源。部分茶树经过长期的自然选择，与不同种类的茶树进行基因交流，使得大别山区的部分茶树资源也发生了转变。随着污染日益严重，许多动植物种类已经消失，因此，通过对大别山区茶树种质资源的分析研究，可以为茶树的保护以及育种等提供参考性依据。
基金项目：2017年安徽省教育厅自然科学研究一般项目“大别山区茶树种质资源多样性的ISSR分析”（KJ2017B03）。
参考文献
[1] 王小萍，张厅，黄梅等.四川地区茶树种质资源叶表型性状多样性分析[J].中国农学通报，2018，34（04）：89-94.
[2] 黎钊，肖斌，余有本等.基于STR分型检测技术的89份茶树种质资源遗传多样性分析[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2017，45（01）：140-146.
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