福州地区柑橘种质资源的ISSR分析

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　　摘要：研究利用ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记技术对21份福州地区柑橘种质资源进行遗传多样性分析，以期为福州地区柑橘的品种鉴定及育种提供理论依据和技术支持。试验从27条ISSR引物中筛选出多态性好、条带清晰的14条引物，对供试材料进行遗传多态性分析。获得162条总条带，其中多态性条带129条，多态位点百分率为79.63%;聚类结果显示21份资源可分为5个组，13份福橘被聚为同一组，进而可划分为4个亚组。ISSR标记能较好地区分福州地区柑橘资源，且福州柑橘地方资源遗传多样性丰富。
　　关键词：柑橘;种质资源;福州;ISSR分子标记;遗传多样性
　　中图分类号：S666.2
　　文献标志码：A
　　论文编号：cjas18080021
　　0引言
　　柑橘（Citrus reticulata）是芸香科属植物[1]，喜温暖湿润气候。一般适合在12.5-37℃的温度下生长发育，也与日照、水分、土壤以及海拔等环境条件紧密相关。柑橘栽培历史悠久，色彩绚丽的柑橘全身都是宝，不仅有很高的食用价值而且还具有药用及保健功效[2-3]。不过，与其他果树相比，柑橘易发生种间杂交及与其近缘枳属、金柑属之间的杂交，还受到芽变、环境及栽培方式等影响，以致发生了遗传变异而拥有众多遗传资源[4]。福州位于欧亚大陆东南边缘，东临太平洋，是典型的亚热带湿润季风气候，年平均降水量900-2100mm，年平均气温16-20℃，海拔多在600-1000m之间。因此，气温适宜和雨水充足的福州适合柑橘的广泛种植及新品种的培育。但是，福州地区柑橘品种鉴定及其研发利用仍处于滞后阶段，研究其种质资源遗传多样性对遗传改良和优异种质资源保护具有重要意义。目前，已有较多关于柑橘遗传多样性的研究报道，但鲜有针对福州地区柑橘资源的评价研究[5-7]。本研究利用ISSR分子标记技术对福州地区的部分柑橘种质资源进行遗传多样性及亲缘关系评价，以期为福州地区柑橘种质资源的创新、研发利用及保护提供理论基础。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　21份柑橘种质资源采自福州市农业科学研究所柑橘种质资源圃（表1）。选取新生幼嫩、无病害叶片置于锡箔纸中，液氮速冻后于-80℃冰箱保存备用。试验中所用试剂药品均由北京全式金生物技术有限公司提供。
　　1.2DNA的提取与纯化
　　选取健康幼嫩的柑橘叶片，参考改良过的CTAB-mini法[8]提取叶片基因组DNA，测定其纯度，用1%琼脂凝胶电泳检测DNA，并用紫外分光光度计测定浓度与纯度质量。最终将DNA稀释到25ng/μL，于-20CC冰箱保存备用。
　　1.3ISSR反应条件建立及引物筛选
　　通过对基因组DNA浓度、TaqDNA聚合酶、引物、Mg2+、dNTP、退火温度等主要因素的调整、优化，确定ISSR-PCR扩增反应总体积为20μL，PCR反应液含有的组分和终浓度为：DNA模板1μL（20ng/μL），引物1μL（10μmol/L），2×Easy Taq PCR SuperMix 10μL，ddH2O8μL。
　　實验根据加拿大温哥华哥伦比亚大学ISSR引物库数据，查阅文献选取27条引物，并委托福州尚亚生物技术有限公司合成。在引物筛选中，以随机挑选的5个样品的DNA为模版进行ISSR-PCR扩增，最终挑选出14条引物。
　　1.4ISSR扩增及产物检测
　　扩增反应在PCR扩增仪上进行，扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，最适退火温度下退火1min（退火温度随引物而定），72℃延伸1min，经过35个循环后，72℃延伸10min。
　　扩增产物检测：以Trans2K Plus DNA Mark为分子量标记，在0.5xTBE缓冲液中，于2%琼脂糖凝胶，90V电压下电泳50min，用Britain GGM/D2凝胶成像系统拍照保存。
　　1.5统计学处理
　　对各居群ISSR-PCR产物的电泳图谱进行判读，每个电泳图谱中同一扩增位点上有条带记作“1”，无条带记作“0”，得到由“1”和“0”组成的二元式数据矩阵[9]。运用NTSYS-pc2.1Oe软件的Dice方法计算遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析，建立聚类分析树状图[10]。
　　2结果与分析
　　2.1引物筛选
　　从27条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性高且重复性好的引物，编号依次为Z810、Z825、Z807、Z834、Z840、Z855、Z873、Z809、Z826、Z842、Z847、Z848、Z867、Z881，用于21个样本的遗传多样性分析。图1为引物对柑橘15个样本总DNA进行ISSR扩增的琼脂糖电泳图谱。
　　2.2ISSR扩增结果
　　筛选的14条引物共扩增出清晰可重复的条带162条，平均为11.57条，扩增产物主要介于250-3000bp，扩增条带数最少和最多的引物分别是Z848、Z881，各扩增出7条和17条条带。其中多态条带129条，平均多态位点百分率占79.63%;多态性最低的引物是Z842，多态性为60%;多态性最高的引物是Z825，多态性高达100%。
　　2.3 21份福州地区柑橘的群体结构分析（基于距离聚类）
　　采用NTSYSpc2.le软件根据Nei's遗传一致度，利用非加权配对算数平均法（unweighted pair groupmethod using arithmetic average，UPGMA），对供试的21份柑橘个体进行遗传关系聚类，得到福州柑橘聚类树状图（图2）。如图所示，当以遗传相似系数0.72为阂值，可将供试的21份材料划分为5组（A、B、C、D、E）。A组包含5份资源，在组中‘日辉’、‘红皮桔’相聚，‘鲁宾诺’、‘托马特拉相聚’，再与‘秋辉’聚类，说明‘日辉’与‘红皮桔’亲缘关系较近，‘鲁宾诺’与‘托马特拉’亲缘关系较近。当以遗传相似系数0.80为阈值，A组又可分为3个亚组，‘日辉’与‘红皮桔’、‘鲁宾诺’与‘托马特拉’依然聚类为一组，而‘秋辉’独立一组，这说明‘秋辉’与‘鲁宾诺’、‘托马特拉’的亲缘关系相对较远。B组包含13份资源，具体为‘闽清2号’、‘闽清新1’、‘东岱’、‘闽清1号’、‘珠心胚1号’、‘珠心胚2号’、‘闽侯大义’、‘江南横槎’、‘砂糖橘’、‘芦柑’、‘温州蜜桔’、‘新余蜜桔’和‘日本桔’，且这13份柑橘种质资源都为福橘并存在一定的亲缘关系。当以遗传相似系数0.80为阈值，可将B组资源分成为4个亚组。B1‘闽清2号’、‘闽清新1’、‘东岱’、‘闽清1号’、‘珠心胚1号’、‘珠心胚2号’、‘闽侯大义’、‘江南横槎’;B2‘砂糖橘’、‘芦柑’;B3‘温州蜜桔’、‘新余蜜桔’;B4‘日本桔’。说明亚组内各资源可能存在相对密切的亲缘关系。C组为‘黄果柑’单独成组，为柑类;D组为‘黑纳蒂娜’单独成组，为杂柑类;E组为‘桔柚’单独成组，为桔柚类。 　　3结论与讨论
　　在柑橘亲缘关系及遗传多样性分析方面，已采用RAPD、AFLP、SSR、ISSR等分子标记技术进行研究[5-7.11-15]。王三红等[16]应用RAPD技术对脐橙品系和葡萄柚品系进行鉴别;谢让金等[17]利用AFLP分子标记对真正柑橘果树群6属植物间以及柑橘属各主要类型（种）的进化关系进行了详细的讨论;辜青青等[18]利用SSR标记技术对28份南丰柑橘资源进行基因组多态性分析，他们发现南丰广橘品种群中‘蜜广’与南丰蜜橘品种群亲缘关系较近，而‘红广’与亲本南丰蜜橘和‘红橘’的亲缘关系均较远;施维属等[19]运用ISSR分子标记法发现24份甜橙种质资源间的亲缘关系相对较近，并找到了鉴定不同品种的特异性标记。
　　ISSR既综合了RFLP、RAPD及SSR等分子标记技术的各种优点，又具有较高的多态性和稳定性，无需预知物种DNA信息背景，操作简单，成本低，广泛应用于植物的遗传多样性研究[11.20-22]。因此，本研究采用ISSR分子标记技术，并通过筛选得到14对高效ISSR引物对21份样品进行遗传多样性分析，共检测到位点162个，多态率高达79.63%，多态性较高，表明供试柑橘基因组DNA具有明显的遗传差异，具有较高的遗传多样性。此次试验所选的21份柑橘种质资源均采自福州地区，其中13份柑橘种质资源为福橘，意在探究福橘与其他引进品种之间的亲缘关系，以便对地方特色柑橘种质资源进行更好地保护和遗传改良。因柑橘叶片中富含酚类、单宁及多糖等干扰物质增加了基因组提取难度，施维属等[8]采用液氮下研磨柑橘叶片进行DNA提取。传统的酚-氯仿提取操作繁琐且有毒，而本研究所用的磁珠法核酸提取技术操作简单、毒性低且可多个样品同时提取，效果明显优于传统方式。
　　遗传一致度是从相同的方向对供试的柑橘进行遗传关系方面的分析，亲缘关系越近的柑橘遗传一致度系数越接近[23-25]。根据ISSR分子标记技术所产生的“1”、“0”矩阵数据，并利用NTSYSpc2.1软件根据Nei's遗传一致度，利用UPGMA法对福州21份柑橘种质资源进行聚类与分析，由图2分析，供试柑橘之间的遗传相似系数变化范围在0.64-0.96。遗传相似系数在0.64处，21份柑橘资源可以分成2类，即桔柚类和余下20份柑橘资源聚成1类。当以遗传相似系数0.72为阈值可将供试的21份材料划分为5组。聚类分析结果显示同一类别的柑橘种质资源遗传关系较近，往往划分在同一组。本研究表明ISSR可有效揭示福州种质资源的遗传多样性、亲缘关系和遗传分化程度，为探讨福州地区柑橘的适应性和生存力提供基础数据，能够及时为濒危品种制定科学有效的保护方案并采取相应的措施。
　　4问题与展望
　　利用ISSR分子标记技术能有效地鉴定柑橘不同品种及分析种质资源的遗传多样性，但所需引物需要具有更强的专一性，为此在筛选引物时增加了试验工作量;同时，需要一定时间摸索PCR扩增的最适反应条件;此外，ISSR分子标记呈显性遗传标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型[26]。在计算遗传相似系数时可能存在无法避免的偏差，有些长度刚好相等的条带出现在同一个位置上，但并不一定来自基因组上的同一区域。因此，对柑橘分类的研究应该考虑各方面的影响因素综合分析。今后柑橘遗传图谱研究中，可利用ISSR标记和其他分子标记技术联合来共同构建，并可利用与目标质量性状基因紧密连锁的分子标记进行质量性状选择，如抗病性、抗虫性和抗盐性等。同时，充分利用ISSR分子标记进行柑橘种质资源的鉴定及新种质的创新，还应注重分子标记与丰富的传统育种经验相结合，提高柑橘在农产品市场上的竞争力。
　　参考文献
　　[1]Velasco R，Concetta L. A genealogy of the Citrus family[J]. NatBiotechnol， 2014（32）：640-642.
　　[2]赵霖，赵和.柑橘类水果的营养与健康[J].现代阅读，2018（4）：98-99.
　　[3]童红梅.柑橘类橙皮素的药用价值及应用[J].甘肃农业科技，2011（9）：38-40.
　　[4]张敏，邓秀新.柑橘芽变选种以及芽变性状形成机理研究进展[J].果树学报，2006（6）：871-876.
　　[5]刘通，邓崇岭，程土芳，等.利用SSR和SRAP技术分析广西柑橘种质遗传多样性[J].华中农业大学学报，2016（2）：23-29.
　　[6]施维属.福建相橘种质资源ISSR分子评价[D].福州：福建农林大学，2010.
　　[7]郭丽英，黄桂香，何新华，等.扁柑种質资源亲缘关系的ISSR分析[J].热带作物报，2011（3）：443-446.
　　[8]施维属，潘腾飞，钟凤林，等.柑橘基因组DNA快速提取及ISSR-PCR扩增体系优化[J].生物技术通报，2009（10）： 109-113.
　　[9]周敏，高慧新，王孝勋，等.鸡血藤ISSR反应体系的建立与优化[J].江苏农业科学，2017（17）：54-56.
　　[10]林立，王志龙，付涛，等.39个樱花品种亲缘关系的ISSR分析[J].植物研究，2016，36（2）：297-304.
　　[11]黄绿红，刘咏红，李高阳，等.ISSR标记技术在湖南柑橘主要品种亲缘关系研究中的应用[J].湖南农业科学，2012（17）：117-119，122.
　　[12]Laigou G A. Genetic relationships in cultivated tea clones andnative wild tea in Taiwan using RAPD and ISSR markers[J]. BotBull Acad Sin，2001.42：93-100. 　　[13]Sharaf A A，Abkenar A A. Sharafi A，et al.Genetic variationassessment of acid lime accessions collected from south of lranusing SSR and ISSR molecular markers[J]. Physiol Mol Biol Plants，2016.22（1）：87-95.
　　[14]Munankarmi N N，Rana N，Bhattarai T， et al Characterization ofthe Genetic Diversity of Acid Lime （Citrus aurannfolia （Christm.）Swingle） Cultivars of Eastem Nepal Using Inter-Simple Sequence Repeat Markers[J]. Plants.2018，7（2）：46.
　　[15]贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种[J].中国农业科学，1996（4）：2-11.
　　[16]王三红，陈力耕，章镇，等.RAPD在柑橘品系鉴别上的应用[J].果树科学，2000（1）：70-72.
　　[17]谢让金，周志钦，邓烈.真正柑橘果树类植物基于AFLP分子标记的分类与进化研究[J].植物分类学报，2008（5）：682-691.
　　[18]辜青青，曾涛，魏清江，等.基于SSR标记技术的南丰柑橘种质资源亲缘关系研究[J].果树学报，2017，34（6）：653-659.
　　[19]施维属，王江波，李开拓，等.24份甜橙种质资源的ISSR分析[J].热带作物学报，2010（6）：902-907.
　　[20]McGregor C E， Lambert C A， Greyling M M. et al. A comparativeassessment of DNA fingerprinting techniques （RAPD， ISSR， AFLPand SSR） in tetraploid potato （Solanum tuberosum L.） germplasm[J].Euphytica，2000，113（2）： 135-144.
　　[21]代惠萍，赵桦，贾根良，等.ISSR指纹图谱分析鉴定油茶遗样性的研究进展[J].西北林学院学报，2013，28（6）：88-91.
　　[22]宋晓兵，彭埃天，刘景梅，等.ISSR分子标记及其在中国南方果树上的应用[J].广东农业科学，2009（7）：199-201.
　　[23]雷天刚，何永睿，彭爱红，等.贵州部分柑橘地方品种遗传背景的SSR分析[J].西南大学学报，2015（11）：30-35.
　　[24]王炯，龚桂芝，彭祝春，等.基于COSMarker分析柑橘属及其近缘、远缘属植物的遺传与进化[J].中国农业科学，2017，50（2）：320-331.
　　[25]刘冰浩，邓崇岭，陈传武，等.广西地方柑橘资源的ISSR分析[J].果树学报，2015，32（6）：1001-1006.
　　[26]张立荣，徐大庆，刘大群.SSR和ISSR分子标记及其在植物遗传育种研究中的应用[J].河北农业大学学报，2002（1）：90-94.
　　基金项目：福建省科技计划项目“福桔种质资源的收集、保存、利用和创新”（2017N0060），“都市特色园艺作物种质资源保护与创新利用”（2016N3018）。
　　第一作者简介：赵依杰，男，1970年出生，福建长乐人，研究员，硕士，研究方向：瓜果品种选育与栽培生理。通信地址：350018福州市仓山区城门石步275号福州市农业科学研究所，Tel：0591-83508677，E-mail：zyjie1970@163.com。
　　通讯作者：胡章琼，女，1974年出生，湖北公安人，副研究员，研究方向：果树栽培与育种。通信地址：350018福州市仓山区城门石步275号福州市农业科学研究所，Tel：0591-83508677，E-mail：549392473@qq.com。
　　收稿日期：2018-08-23，修回日期：2019-02-26。
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