除草剂室内高通量筛选方法研究

来源:用户上传      作者: 张志刚 杨自文 王开梅 张亚妮 张遵霞

　　摘要：以狗牙根为材料，对除草剂筛选的限制因素进行了研究。结果表明，水分流失和真菌污染是引起筛选结果不稳定的主要因素；运用多种规格的组织培养板和雾化补水可以控制水分流失对筛选的不利影响；添加抗真菌剂和对种子进行杀菌处理可以消除真菌污染对靶标的侵害和延长试验的可观察时间。进一步的筛选试验结果表明，运用以上方法能够稳定、高效地对不同来源的样品进行筛选。
　　关键词：高通量筛选；除草活性；种子处理；抗真菌剂
　　中图分类号：Ｓ４８２．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）24－5119-03
　　
　　Study on High Throughput Screening of Herbicide
　　
　　ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ－ｇａｎｇ，ＹＡＮＧ Ｚｉ－ｗｅｎ，ＷＡＮＧ Ｋａｉ－ｍｅｉ，ＺＨＡＮＧ Ｙａ－ｎｉ，ＺＨＡＮＧ Ｚｕｎ－ｘｉａ
　　（Ｈｕｂｅｉ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ／Ｔｈｅ Ｂｒａｎｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ， ｖａｒｉｏｕｓ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｇｒａｓｓ ｉｎ ｔｅｓｔｉｎｇ ｐｌａｔｅｓ were studied． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｓｏ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ was advanced ｔｏ ｂｒｅａｋ ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｔｈｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｓｔｉｎｇ ｐｌａｔｅｓ ａｎｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｂｙ ｔｈｅ ａｔｏｍｉｚｅｒ； ｂｙ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ ａｎｄ ｓｅｅｄｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｓｏｌｖｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｔｅｓｔｉｎｇ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｌｅｎｇｔｈｅｎｅｄ． Ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｔｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ ａｂｏｕｔ １２８０ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： hｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； hｅｒｂｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ； sｅｅｄｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ； fｕｎｇｉｃｉｄｅ．
　　
　　直接应用目标杂草进行除草剂筛选具有针对性强、活性反应真实、直观等优点，在新药发现方面更具有独特的优势。而对于来源多样、理化性质复杂及数量巨大的样品，直接使用目标杂草进行筛选存在着操作复杂、工作量大、活性重现性差、可观察时间短等诸多瓶颈。本试验以狗牙根种子为筛选起点，使用琼脂为载体对除草剂室内高通量筛选的限制因素进行了探索［１］，同时选择３个标准样品和一些不同来源的样品进行了筛选，旨在找到高效、稳定的除草剂室内高通量筛选方案。
　　１ 材料与方法
　　１．１ 试验材料
　　１．１．１ 种子 狗牙根种子发芽率大于７０％，保藏温度为１７～２０ ℃。
　　１．１．２ 培养基原料 琼脂粉（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，型号ＤＨ０１０－４）、ＰＤＢ培养基原料（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ & CO.）。
　　１．１．３ 试剂及标准样品 试剂丙酮、乙醇、二甲基亚砜、吐温－８０均为市售分析纯，抗菌剂特比萘芬、放线菌酮、嘧菌酯、咪鲜胺为市售分析纯，除草剂标准样品乙草胺、草甘膦、硝磺酮为市售原药。
　　１．１．４ 供筛选试验样品 化学合成物由湖北省生物农药工程研究中心绿色化学研究室提供，真菌和放线菌发酵提取物由湖北省生物农药工程研究中心微生物工程研究室提供，微生物源先导化合物及植物提取物由湖北省生物农药工程研究中心先导化合物分析室提供。
　　１．１．５ 主要仪器、设备 Ｂ１００－１Ｆ蠕动泵、ＫＱ－２５０ＤＥ型数控超声波清洗器、医用雾化器、ＢＩＯＨＩＴ ｅＬＩＮＥ（ＭＣＥ８ｋ）电子移液器、Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈ Ｌａｂ ＤＶ８－２００移液器、人工气候室（光、温、湿可调）、经过灭菌处理的９６孔组织培养板和深孔组织培养板、ＪＮ．ＧＬ １００ Ｗ ＬＥＤ植物生长灯（０．４ ｍ距离光照度为３ ５００～４０００ ｌｘ）、生物安全柜。
　　１．２ 试验方法
　　１．２．１ 狗牙根生长试验 试验设４个处理组：第一组为载体对照组，把０．７％的琼脂加入９６孔组织培养板，每孔加入量为０．２ ｍＬ；第二组为种子对照组，在作为载体的琼脂表面接入未经处理的狗牙根种子，接入量约为２０粒／孔；第三组为种子杀菌处理组，在琼脂表面接入经过杀菌处理的种子，接入量约为２０粒／孔；第四组为加入营养成分的载体对照组，把真菌培养基（已加入抗细菌剂重铬酸钾，终浓度为０．０２０ ｍｇ／ｍＬ）加入９６孔组织培养板。组织培养板移入７０ ｃｍ × ４０ ｃｍ × １５ ｃｍ的无盖白色食品盆中，盆口以透明塑料薄膜覆盖。所有培养盆均在人工气候室中培养（３０ ℃、相对湿度７０％～８０％、光照１４ ｈ／ｄ，光源１００ Ｗ ＬＥＤ植物生长灯距植物２０～２５ cm）。每个处理组使用３个组织培养板，每组设２个重复。每天称取培养板重量，并计算各组水分流失的平均值。同时观测４、７、１４ ｄ时植物生长状况及真菌污染情况。
　　１．２．２ 培养板中真菌的分离及抑菌试验 从１．２．１生长试验中培养１４ ｄ后的组织培养板中分离真菌，并进行纯化培养［２］，使用管碟法半定量测定特比萘芬、放线菌酮、嘧菌酯、咪鲜胺对分离获得的３个真菌纯培养的抑菌效果［３］，根据抑菌圈的大小进行抑菌活性分级。各抗真菌剂使用３个浓度梯度（０．０２０、０．０１０、０．００２ ｍｇ／ｍＬ）进行试验。
　　１．２．３ 抗菌剂及种子处理的应用效果试验 根据１．２．２的结果，选择抑菌活性最强和最弱的抗菌剂。试验中使用的狗牙根种子分为２组，一组为未处理的普通种子，另一组以温汤法进行杀菌处理［４］。
　　１．２．４ 稳定性试验
　　１）活性评价指标。根据活性反应的不同，使用２项指标标记除草活性。一是以株高为指标进行标记，按０、３、５、７、９分级。０表示无活性，指标为株高与阴性对照组株高一致； ９表示活性为１００％，指标为种子未萌发。在０与９之间设置３个级别，对于植株株高明显高于阴性对照的样品标记为“Ｓ”。二是以植株黄化程度为指标进行标记，按０、３Ｙ、５Ｙ、７Ｙ、９Ｙ分级，０表示无活性，指标为植株黄化程度与阴性对照组一致，所有植株均发生黄化标记为“９Ｙ”，在０与９Ｙ之间设置３个级别。

　　２）标准样品稳定性筛选试验。作为植物生长载体的琼脂（０．７％）中加入嘧菌酯，终浓度为０．００２ ｍｇ／ｍＬ。种子经过灭菌处理。３个标准样品母液浓度为１．００ ｍｇ／ｍＬ，以无菌水稀释成１２个浓度。９６孔组织培养板中琼脂表面涂布样品溶液量为０．０１ ｍＬ／孔，每个浓度设２个重复。试验重复５次。培养条件为温度３０ ℃、相对湿度７０％～８０％，光照时间１０ ｈ／ｄ，光源为１００ Ｗ ＬＥＤ植物生长灯距植物２５～３０ cm。
　　３）不同来源样品的筛选试验。随机选择不同来源的样品１ ２８０个，其中包括化学合成物６４个、微生物发酵提取物１０５６个、微生物源先导化合物６４个及植物提取物９６个。将以无菌水稀释后的样品溶液涂布到琼脂表面，样品浓度为１．００ ｍｇ／ｍＬ，涂布量为０．０１ ｍＬ／孔，然后接入狗牙根种子［５］。以无菌水为空白对照。每个处理设３个重复。琼脂、种子灭菌处理及培养条件同上。
　　２ 结果与分析
　　２．１ 种子在琼脂上的生长试验
　　２．１．１ 培养板水分流失试验 培养板水分流失不仅影响植物的正常生长和试验的可观察时间，而且会引起样品浓度的变化。在培养９ ｄ后，水分流失５０％左右；接入了种子的培养板较未接入种子的培养板中水分流失更多。
　　
　　
　　２．１．２ 真菌污染试验 以目测法对琼脂表面真菌生长情况及植物生长情况进行观测。结果（表１）显示，引起培养板中真菌污染的真菌来源于种子和培养环境；并且种子为真菌生长的营养来源；真菌菌丝的密集生长引起培养孔中的植株发生黄化，即造成假阳性结果；假阳性率与真菌感染率正相关。
　　２．２ 真菌的分离及抑菌试验
　　从１．２．１试验中培养１４ ｄ的组织培养板中分离得到３种真菌纯培养物，初步鉴定为根霉、曲霉和蠕孢霉。应用管碟法测定抑菌效果的结果（表２）显示，嘧菌酯对３种真菌抑制效果最好，咪鲜胺效果最差，其他２种抗菌剂抑菌活性居中。
　　２．３ 抗真菌剂及种子处理的应用效果试验
　　抑菌试验结果见表３，种子杀菌处理和抗真菌剂对控制真菌污染都有明显的作用；嘧菌酯表现出良好的抑菌能力，而咪鲜胺的抑菌效果差，该结果与管碟法所测定的抑菌活性结果一致。
　　２．４ 稳定性试验
　　２．４．１ 标准样品稳定性试验 对３个不同类型的标准样品进行稳定性试验，培养７ ｄ后按目测分级法，根据株高及植株黄化程度进行分级。从表４可以看出，标准样品稳定性试验中５次重复的变异系数（CV）均在3０％以下。作为以快速定性为目标的除草剂室内高通量筛选方法，这一指标已经达到要求。
　　２．４．２ 不同来源样品的筛选试验结果 筛选试验中所有培养板中均无真菌浸染，各重复活性反应一致；１ ０５６个微生物发酵提取物中检出活性样品９个；６４个微生物源先导化合物中检出活性样品１个；６４个化学合成物和９６个植物提取物中均无活性样品检出。
　　３ 讨论
　　与滤纸平皿法、盆栽法等筛选方法比较，使用琼脂平板作为载体的筛选方法具有可自动化程度高、可观察时间长、样品消耗少、筛选通量大等优点。在水分流失和真菌污染对靶标的影响得到控制后，筛选结果稳定。本试验中选用的狗牙根种子较小，其生物量增长慢，仅通过提高水分总量（如使用深孔板或孔径较大的培养板等）就可以达到延长可观察时间的目的。对于子粒较大的种子，因其生物量增长速度快，水分消耗速度也较快，则需要补水。在除草剂筛选过程中，作为筛选靶标的植物种子为真菌的生长提供了充足的营养，因此真菌在培养板中生长迅速；而且在高湿、弱光照的小环境中，快速滋生的真菌会严重影响种子的正常萌发和植株的正常生长，进而影响筛选结果的准确性，因此抗菌剂的使用成为必要。随着现代农用抗菌剂的发展，可供选择的抗真菌剂越来越多，抗菌剂对除草剂活性存在的协同或颉颃影响尚待进一步研究。
　　
　　参考文献：
　　［１］ 逄 森，袁会珠，李保同，等．利用９６孔板建立除草剂微量活体筛选方法初探［Ｊ］．农药学学报，２００５，７（４）：３３４－３３８．
　　［２］ 梁 晨，吕国忠． 土壤真菌分离和计数方法的探讨［Ｊ］． 沈阳农业大学学报，２０００，３１（５）： ５１５－５１８．
　　［３］ 李 凡，朱志华，姜凤丽，等． 管碟法测定生物效价影响因素的探讨及改进［Ｊ］． 中国兽药杂志，２００８（１）：４５－４８．
　　［４］ 张志元，罗永兰，官春云．油菜种子内生菌的检测及杀菌消毒处理方法［Ｊ］．湖北农业科学，２００５（１）：５２－５５．
　　［５］ 许勇华，台方俊，陈 杰． 新农药创制中除草活性评价程序及方法概述［Ｊ］． 现代农药，２００９（５）：１７－２０．

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