罗格列酮对脂多糖诱导人冠状动脉内皮细胞功能障碍的改善作用及机制

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　　摘要：目的：探讨罗格列酮（rosiglitazone ，RSG）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）功能障碍的作用及机制。方法：将HCAEC分为空白对照组、脂多糖组（分别用0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L四种浓度的LPS刺激HCAEC，同时设立对照组，用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞活力后选出最适浓度）、罗格列酮（RSG）组、脂多糖+罗格列酮（LPS+RSG）组，采用Western blot（蛋白免疫印迹法）测定缝隙连接蛋白43（Cx43）的表达量。结果：（1）MTT法检测四组LPS浓度对细胞活力影响的结果显示，随着LPS浓度增加（LPS浓度≥1 mg/L），抑制HCAEC作用增强，导致其活力降低（P<0.05）；（2）由Western blot结果表明，LPS组对比空白对照组，Cx43的表达量增多；HCAEC中加入RSG预处理1h后+LPS共培养组较LPS组，Cx43蛋白的表达水平下降（P<0.01）。结论：RSG能抑制LPS诱导的HCAEC中Cx43表达的增加，减轻冠状动脉内皮细胞功能损害，从而延缓动脉粥样硬化的进展。
　　关键词：罗格列酮；缝隙连接蛋白43；脂多糖；人冠状动脉内皮细胞
　　【中图分类号】361.3 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）02-160-03
　　前言
　　随着国家综合实力的提升，人民生活质量不断改善以及计划生育的施行，中国人口老龄化问题日渐突出，随之而来，城乡居民中患动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）疾病占比较前增多。据世界卫生组织估计，与动脉粥样硬化和再狭窄相关的心血管疾病可能是未来十年发展中国家导致死亡的主要原因[1， 2]。研究表明，在AS的形成过程中，血管内皮的缝隙连接蛋白（connexins，Cx）[3]发挥了重要作用。罗格列酮可通过p38 MAPK信号通路抑制炎症反应。该实验通过观察罗格列酮对LPS诱导的HCAEC中Cx43表达水平变化的影响，探讨罗格列酮是否有抑制血管炎症反应的作用。
　　1.材料与方法
　　1.1 实验试剂
　　原代HCAEC、内皮细胞完全培养基、青-链霉素（P-S）、胰蛋白酶、MTT、LPS、RSG、二甲基亚砜（DMSO）、RIPA裂解液、BCA蛋白试剂盒、兔抗鼠Cx43、兔抗鼠GAPDH内参蛋白抗体、羊抗兔荧光二抗。
　　1.2主要试剂配制
　　LPS用无血清的培养基溶解，RSG用DMSO溶解，磷酸盐缓冲液（PBS）溶解MTT，以上三种溶液放于-20℃冰箱保存。
　　1.3 细胞培养
　　将HCAEC从液氮罐中取出置于37℃水浴箱中，溶化后立即转移到含9ml完全培养基的25cm?培养瓶中，于恒温培养箱中培养，酌情1-3天换液一次，待瓶内细胞密度达80%以上即可传代。以2-5代为最佳研究对象。
　　1.4 实验分组及处理
　　（1）LPS对细胞活力影响的检测：用MTT法检测五组浓度梯度的LPS处理HCAEC 24h后的细胞活力；（2）Western blot法测定以下四组细胞（①空白对照组、②0.1mg/L LPS组、③10ug/ml RSG组、④0.1mg/L LPS+10μg/ml RSG组（先LPS预处理1h后再予RSG共同处理24h））中Cx43蛋白的表达量，上述四组细胞均培养24h后提取总蛋白。
　　1.5 MTT法检测细胞活力
　　当细胞在对数生长期且密度达80%-90%时，胰酶消化，离心，吹打重悬，于96孔板中每孔接种1×104 个细胞，每个浓度设4个复孔，放培养箱中培养24h，至细胞贴壁生长时，在无血清条件下以不同浓度LPS处理HCAEC 24h，在每孔加入20μl的MTT溶液，放入培养箱中培养4h后，吸弃复孔的上清液，每孔加入150μlDMSO，摇床振荡10 min，待结晶溶解后选择波长490nm的酶标仪测其吸光度值。
　　1.6 Western blot法检测HCAEC中Cx43蛋白的表达量
　　将HCAEC接种于六孔板上，根据不同组的条件分别处理HCAEC后弃去培养液，使用冷却的1×PBS清洗3次后弃去，冰上加入提前装有PMSF的RIPA裂解液裂解10min，用离心管收集细胞刮刮取的裂解物后离心，取一小部分用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，剩余上清液放入1.5ml离心管后加入上样缓冲液后置于100℃沸水中变性13分钟。行SDS-PADE电泳，每道上样20μg蛋白，湿转至PVDF膜，1×TBST 洗膜5 min×3次，5%脱脂奶粉封闭1h， TBST洗三次，蛋白一抗4℃孵育过夜， TBST洗三次后加入荧光二抗，室温摇床孵育1 h， TBST洗3次，Odyssey双色红外荧光成像系统扫描成像，Image-J图像分析软件分析各条带灰度值，以目的蛋白Cx43与内参GAPDH灰度值的比值反映其相对表达量。
　　1.7 统计学方法
　　采用SPSS 25.0进行分析，计量资料以均数±标准差（X±s）表示，多组组间总体均数的差异比较用单因素方差（one way ANOVA）分析，组间两两比较用SNK检验，当P<0.05为差异有统计学意义。
　　2.结果
　　2.1 不同浓度LPS对人冠状动脉内皮细胞活力的影响
　　不同浓度梯度LPS处理HCAEC 24h后，以空白组为对照，当LPS浓度大于1mg/L时，HCAEC活力降低（P<0.05），且随着LPS浓度升高，对HCAEC活性的抑制作用增强。因此，选择0.1mg/L LPS作为后续实验的处理浓度。
　　2.2 不同处理对HCAEC中Cx43蛋白水平的影响
　　与对照组（0.45±0.015）相比，LPS組Cx43蛋白（0.58±0.004， P<0.01）水平显著上升；与LPS组相比，LPS+RSG组Cx43蛋白（0.32±0.025， P<0.01）水平显著下降。 　　3.討论
　　动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特点是在受累及的动脉某些部位的内膜下发现脂质沉积，伴血管平滑肌细胞增殖和纤维基质成分聚集，进一步发展成动脉粥样硬化斑块。脂多糖是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分，通过与内皮细胞跨膜受体Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）结合，激活G蛋白激酶传导通路，引起细胞内靶蛋白的磷酸化，促使细胞骨架蛋白的解聚和重组，细胞间缝隙形成，进而改变内皮细胞的形态及功能，导致内皮细胞功能障碍，促进AS的发生发展[4]。
　　缝隙连接（gap junction） 是由缝隙连接蛋白（ connexin，Cx）组成的哺乳动物细胞膜上的一个特定区域，为细胞间离子、小信号分子、第二信使的直接流通通道，协调细胞的生长及分化的生理过程。作为细胞间相互连接的主要方式，与动脉粥样硬化的形成产生重要作用。缝隙连接蛋白是一种在多种组织中表达的蛋白质的同质家族[5]，其中三种缝隙连接蛋白参与动脉粥样硬化的形成，分别是Cx37， Cx40 和 Cx43。Cx37和Cx40具有延缓动脉粥样硬化的作用[6， 7]。Cx43在AS发生发展过程中呈表达上调趋势，其主要在平滑肌和血管内皮细胞中表达[4]。在心室组织中存在大量表达由Cx43组成的缝隙连接，具有高转导、低电阻的特点，其作为基础使心脏作为一个功能性合胞体进行同步收缩，在维持心脏正常电生理活动中发挥重要作用[8]。研究证明Cx43通过激活ATP释放，促进单核细胞和血管内皮间的粘附力增加，继而诱发血管炎性反应[9]。Cx43 MAPK 磷酸化是血小板源性生长因子介导的血管平滑肌增生所必需的，而后者在动脉粥样硬化的发生发展中扮演重要的角色[10]。该研究使用LPS处理HCAEC细胞，研究揭示： LPS组中Cx43的蛋白表达水平较空白对照组明显上调（P<0.01）。提示LPS可能通过增加Cx43的表达量进而促进AS的形成。
　　核受体超家族中的核转录因子之一过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ），是脂肪细胞分化的关键调控因子。有研究表明[11]，噻唑烷二酮类合成的PPARγ配体对心血管疾病具有有益的作用。累积的数据表明，PPARγ活化是抵抗素蛋白的重要调控因子[12]，因此有望成为动脉粥样硬化并发症的治疗靶点。PPARγ激动剂罗格列酮可通过MAPK信号传导通路下调动脉粥样硬化斑块病变中的主要蛋白酶MMP-2[13]从而抑制炎症反应过程。在本实验中，使用罗格列酮来拮抗LPS诱导的血管炎症反应，结果显示，与LPS组相比，LPS+RSG组的Cx43蛋白表达量明显下降（P<0.01）。
　　综上所述，LPS可诱导HCAEC中Cx43的表达量增多，而罗格列酮可以抑制LPS诱导HCAEC中Cx43的产生，从而起到抗炎保护作用。这也可能为AS的治疗提供一种新的治疗思路。
　　参考文献
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