细胞自噬、凋亡和坏死性凋亡的分子关系

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　　摘要：大量潜在的致死因素能够对细胞造成损伤，这些因素可以通过激活特殊的分子通路进而杀死细胞。有些死亡方式是根据细胞的形态学变化来定义的，但更多的是通过相关调控分子的作用而进行明确定义。随着对细胞死亡越来越深入透彻的研究，多种不同的细胞死亡通路也得到了更加全面、彻底的阐述，它们之间存在的分子关系也成为研究和争议的热点。本文通过阐明自噬和坏死性凋亡的分子通路及发生原理，对两者控制细胞死亡的特殊分子途径的不同特征及它们之间的分子关系进行了详细描述。
　　关键词：自噬;凋亡;坏死性凋亡;半胱天冬酶
　　中图分类号： Q255文献标志码： A文章编号：1002-1302（2019）16-0006-03
　　收稿日期：2018-04-09
　　自噬是一种“自食”的胞内机制。在这一过程中，蛋白和细胞器被特殊的胞内囊泡包裹，并在溶酶体内蛋白酶的作用下彻底裂解后供细胞重新利用。大多数细胞在休眠状态下会发生低水平的自噬。某些刺激因素能够提高自噬的概率，如营养匮乏等。自噬小体的囊泡能够以非特异性（如大自噬）或特异性（如线粒体自噬）的方式包裹细胞质内容物。UNC-51样激酶（UNC-51-like kinase，简称ULK）蛋白复合体能够诱导自噬小体的形成，也會受到哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，简称mTOR）途径的负调控，而mTOR是1个主要的营养传感器。因此，生长因子和氨基酸的缺失以及化学抑制剂雷帕霉素都可以利用这一通路引发细胞自噬。ULK能够促进自噬小体膜的形成，并激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatylinositol 3-kinase，简称PI3K）复合体Ⅲ，PI3K抑制剂能够在早期抑制自噬的发生。
　　1自噬与细胞死亡的关系
　　促生存BCL-2蛋白家族成员（the pro-survival B cell lymphoma 2 family members）是BH3（BCL-2 homology 3）拟态混合物ABT-737的靶标，这些家族成员能够通过结合自噬蛋白Beclin1（BECN1/ATG6/VPS30）的BH3样结构域直接抑制细胞自噬。当Beclin 1过表达时，BCL-2能够与Beclin 1发生免疫共沉淀。然而最近的研究发现，促生存的BCL-2蛋白家族对自噬的抑制主要依赖于固有凋亡途径功能的完整性。当固有凋亡途径由于BAX基因和BAK基因的敲除而彻底失去功能时，抗凋亡BCL-2家族成员的过表达便无法通过一系列刺激阻止自噬的激活[1]。因此，与BAX和BAK基因对自噬的独立调控相反，BCL-2家族成员或BH3拟态对自噬的调控是间接的。在BAX和BAK基因敲除的细胞中，DNA嵌入剂依托泊苷也能够引起自噬反应，然而，药物是否会因为自噬而引起细胞死亡尚未知。关键自噬基因的敲除是将自噬的功能作为一种细胞死亡类型最清晰的方式。例如，可以通过将Bax-/-、Bak-/-和ATG5-/-型细胞与3种基因均缺陷的细胞进行比较，从遗传学上区分自噬性细胞死亡。有研究表明，在果蝇发育期间移除中肠结构后，即使在缺乏含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）的情况下，也能够发生自噬现象。在这些试验条件下对自噬基因进行沉默，结果表明，自噬的发生主要是为了消除细胞，并不依赖于caspase的活性。总的来说，自噬途径是一种细胞保存和重复利用资源的机制，可促进细胞死亡。有研究表明，外在的细胞死亡途径中的分子可在自噬的调控中起作用。因此可见，细胞死亡途径和自噬途径应该可以在多水平上互作。
　　2凋亡与坏死性凋亡的关系
　　坏死是一种不可调控的细胞毒素性损伤结果，其发生不需要特殊的分子作用。然而，在最近10年中，人们发现了1种可调控形式的坏死性细胞死亡，并将其称为坏死性凋亡，因为它兼具凋亡和坏死的特征。坏死性凋亡不仅是一种特定的分子级联反应控制的过程，也具有细胞和细胞器肿胀导致细胞裂解的特征。裂解后释放的大量细胞内容物可作为损伤相关分子模型（damage-associated molecular patterns，简称DAMPs），例如mt DNA、HMGB1、IL-33、IL-1或S100a9等，均能增强炎症反应[2]。坏死性凋亡与大量的炎症病理相关，如胰腺炎、肠炎和疾病感染等[3-7]。
　　1998年，Vercammen等首次在以肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，简称TNF-α）或Fas L以及caspase抑制剂处理的鼠科L929纤维原细胞中发现了坏死性凋亡特征[7-8]。后来的研究表明，在出现多种刺激的情况下，如TNF受体的信号通路、T细胞受体刺激、干扰素、一些抗癌药物、病原相关分子模式激活RIG-Ⅰ样或Toll样受体、遗传毒性或氧化应激、病毒介导的干扰素（IFN）调控因子的DNA依赖性激活剂（DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors，简称DAI）的激活等，尤其是caspase8的抑制能够引起坏死性凋亡的发生[9-10]。坏死性凋亡的发生过程需要丝氨酸/苏氨酸受体互作蛋白激酶1（receptor interacting protein kinases 1，简称RIPK1）和RIPK3，以及混合系列蛋白激酶样结构域（mixed lineage kinase like，简称MLKL）的参与。目前认为，坏死性凋亡是一种由受体互作蛋白（receptor interacting protein，简称RIP）激酶和混合系列蛋白激酶样结构域（mixed lineage kinase like，简称MLKL）介导的caspase依赖性细胞死亡。从试验角度来讲，这通常与caspase抑制剂的使用或RIPK3/MLKL的敲除、沉默有关。
　　大多数报道的坏死性凋亡刺激都是由于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，简称TNF）的产生和与肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1，简称TNFR1）相关信号通路的激活能够刺激坏死性凋亡的发生。在试验设置中，TNFR1的信号通路中caspase8和cIAPs的活性受到抑制时会促进坏死性凋亡的发生。TNF与TNFR1的结合会导致cIAPs作用下的受体互作蛋白激酶Ⅰ（receptor interacting protein kinase Ⅰ，简称RIPK1）的多聚泛素化，从而在空间上限制RIPK1形成细胞死亡复合体。当cIAPs缺失或利用凋亡抑制剂（inhibitor of apoptosis，简称IAP）处理降解cIAPs后，1种称作RIPoptosome的细胞死亡信号复合体就会形成，由去泛素化的RIPK1、Fsa相关死亡结构域（fas associated death domain，简称FADD）、caspase8和FADD样白介素1β转化酶抑制蛋白[FADD like interleukin-1β converting enzyme （FLICE） inhibitory protein，简称cFLIP]组成[11-12]。在这种动态变化中，细胞的存活主要依赖于caspase8的活性。RIPK1和RIPK3是caspase8的底物，在胚胎发育和炎症反应中，它们的裂解能够引发凋亡，阻止大面积的坏死[13-14]。 　　在caspase8失活的情況下，RIPK1和RIPK3不再发生裂解，两者能够通过其RHIM结构域发生互作，并作为激酶启动坏死性凋亡[15]。坏死小体是由RIPK1、RIPK3与MLKL共同组成的复合物[16]。其中，RIPK1能够使RIPK3发生磷酸化，进而使MLKL磷酸化，直接引发细胞死亡。一旦发生磷酸化，假激酶MLKL会发生构象改变，从而将1个特殊的4螺旋束结构域插入细胞质膜，破坏质膜的完整性[17-19]。最新的研究表明，RIPK1可以通过控制RIPK3的寡聚化抑制自发的RIPK3激活。然而，缺乏RIPK1的细胞会增加自发的RIPK3依赖性的坏死性凋亡，而以坏死性凋亡抑制剂处理后的细胞就不会发生坏死性凋亡[20-21]。围产期致命性的Ripk1基因缺陷小鼠在缺失Ripk3或Mlkl后会得到改善，这就表明RIPK1非依赖性（RIPK3/MLKL依赖性）坏死性凋亡的存在，这与前面的结论一致。Ripk1基因的敲除不能治疗caspase8缺陷型小鼠，而RIPK3的基因缺失可以治疗，这一事实就证明了上述想法[22-23]。进一步的研究表明，由TLR3/4或MCMV引起的坏死性凋亡不依赖于RIPK1[10，24]。
　　由RIP蛋白凋亡体的组分造成的caspase依赖性和非依赖性的死亡应答，仍存在其他水平上的交叉调控，目前很多RIP蛋白凋亡体还没有研究透彻。例如，cFLIP的长同分异构体cFLIPL与caspase8形成了1种具有催化活性的异质二聚体，能够改变caspase8底物特异性的光谱[25]。该二聚体能够通过抑制RIPK3来抑制坏死性凋亡[26]。相反，cFLIP的短同分异构体cFLIPs可抑制caspase8的活性并能在缺乏cIAPs的情况下促进坏死性凋亡复合体的形成[11-12]。最新研究表明，RIPK3和FADD的共缺失能够使cFLIP致死性基因型敲除小鼠存活，但若仅其中1个缺失，小鼠便会死亡[27]。凋亡与坏死性凋亡的另1个分子共调控的例子就是头帕肿瘤综合征蛋白（cylindromatosis，简称CYLD）基因。这一基因编码了1种具有去泛素化功能的细胞质蛋白，在全基因组扫描中将其作为一种坏死调节器。CYLD能够通过促进RIPK1在TNFR1膜受体复合物中的去泛素化而促进坏死性凋亡[28]。caspase8能够通过裂解CYLD抑制坏死性凋亡[29]。总的来说，这些例子可以表明，坏死性凋亡和固有的凋亡途径以一种复杂而有趣的方式进行紧密结合并相互协调。各种细胞死亡方式之间的共调控与这些复杂的互作之间的不同作用都有待研究。
　　3自噬和坏死性凋亡的分子关系
　　在多种细胞死亡方式的复杂关系网中，自噬和坏死性凋亡途径之间的互作关系目前尚不十分清楚。不过，已经有数据证明了这些互作关系。在小鼠纤维原L929细胞的研究中，仅仅是pan-caspase抑制剂zVAD处理就可以引发细胞死亡。部分特征就是自噬小体液泡的形成。由于RIPK1、ATG7或Beclin-1表达量的降低抑制了死亡应答，所以试验数据一方面说明了这些自噬基因有助于坏死性凋亡细胞死亡，另一方面说明caspase激活能够抑制自噬性细胞死亡。对遗传改良小鼠T细胞的研究表明，T细胞激活后，1个由FADD和caspase8构成的DISC样复合体会与RIPK1在自噬小体膜上进行组装。ATG5和FADD之间的蛋白-蛋白互作是这一复合体组装的关键。在功能的水平上，这一模型表明，自噬的某些水平需要正常增殖的T细胞应答。FADD、caspase8和RIPK1都调控着应答的程度，因为FADD和caspase8的敲除增强了自噬，钝化了增殖，同时坏死性凋亡抑制剂对RIPK1的抑制能够在缺乏正常FADD功能的T细胞中恢复增殖应答。最新的研究表明，RIPK3的缺失也能够重建细胞增殖[30]。这一调控水平可检测在克隆繁殖中1种引起T细胞死亡的非调控性自噬发生的可能性。此外，这些数据表明，caspase8活性的调控在T细胞增殖应答的调控中具有重要作用。其他受体信号系统中的自噬和坏死性凋亡途径交叉调控仍需要进一步的研究。
　　4结论
　　相同的有害损伤能够通过不同的分子途径导致细胞死亡。一些信号途径通过相同的分子汇集起来，这些交叉点都是可调控的，细胞可能通过这些点决定它们的死亡方式[31]。同时，有证据表明，某些胞内应激总是利用一种特定的细胞死亡途径，例如BCL-2调控途径。很明显，其他细胞毒素应答也参与多种机制，细胞死亡可以通过这些机制被引发。自噬和坏死性凋亡的交叉点是分子病理学中比较有趣而且容易扩展研究的部分。有时生理学结果是细胞死亡，而激活细胞死亡途径的因子表达量的降低，影响了炎症反应的发生。自噬性细胞死亡和坏死性凋亡反应的结果都是导致细胞死亡，但两者对相似刺激是否有不同的生理学结果仍有待确定，这仍是进一步研究的热门话题。
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