Stattic 影响急性髓系白血病细胞DNA损伤修复与凋亡

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　　【摘要】 目的探讨STAT3抑制剂Stattic对急性髓系白血病（AMI） U937与HL60细胞株的增殖、凋亡及DNA损伤修复的影响。方法分别以不同浓度Stattic处理U937与HL60细胞24 h，以细胞增殖一毒性检测试剂（ CCK8）法检测白血病细胞的增殖活性;以流式细胞技术检测白血病细胞凋亡、细胞周期、DNA损伤以及DNA损伤修复情况。结果U937与HL60的增殖活性随着Stattic浓度的升高而减弱（P均<0.05）。1、2.5、5μM的Stattic均可诱导HL60细胞凋亡增加（P< 0.001）;而U937仅在2.5、5μM浓度的Stattic处理后细胞凋亡才增加（P< 0.001），2种AML细胞凋亡比率均随着Stattic药物浓度增大而增加。2.5、5μM浓度的Stattic可将U937细胞周期阻滞在G2/M期（P<0.05），同时CO/GI期百分比下降（P<0.01）。1、2.5μM浓度的Stattic将HL60细胞周期阻滞在S期，同时G2/M期及Gl/CO期百分比下降（P<0.05），HL60细胞在Stattic 5μM时，SubGI百分比升高。经依托泊苷诱导DNA双链断裂后6h，Stattic处理后的U937与HL60细胞中γ-H2AX荧光强度仍维持在较高水平（P均<0.001）。结论Stattic可能通过诱导白血病细胞发生DNA损伤并阻碍其修复进而促进细胞凋亡。
　　【关键词】 DNA损伤修复;STAT3抑制剂;急性髓系白血病;凋亡
　　急性髓系白血病（ AMI）是起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病。目前化学治疗联合造血干细胞移植仍然是大部分AML患者的标准治疗方案。然而仅40% - 70%的患者可通过化学治疗获得完全缓解。部分患者对化学治疗药物发生耐药[1]。对AML发病机制的研究促进了各类靶向药物的开发与使用。PML/RARA融合基因阳性急性早幼粒细胞白血病患者经全反式维甲酸联合砷剂治疗基本可以达到临床治愈[2]。而酪氨酸激酶3（ FLT3）抑制剂对FLT3-ITD突变AML患者疗效却不理想，表现为缓解期短[1]。部分靶向药物疗效持续时间短或与肿瘤细胞耐药相关。AML发生耐药的相关机制仍需要深入研究，以寻找新的靶向药物。
　　转录激活因子3（ STAT3）是重要的信号转导调节因子，磷酸化后呈活化状态[3]。在大部分肿瘤中STAT3呈持续活化状态[4-6]。抑制STAT3活性可促进肿瘤细胞凋亡[7-8]。研究显示STAT3与DNA损伤修复（ DDR）相关[9-11]。细胞发生基因损伤后即启动DDR。若损伤持续存在，则细胞发生凋亡[12]。许多肿瘤对放射治疗及化学治疗耐药与肿瘤细胞DDR功能活跃有关。在大多数实体肿瘤中，抑制STAT3活性可增加DDR从而促进肿瘤细胞凋亡[10]。笔者目前尚未见STAT3抑制剂干扰白血病患者肿瘤细胞DDR的相关报道，故拟探讨STAT3抑制剂对AML细胞的增殖、凋亡和DDR的影响。
　　材料与方法
　　一、实验材料
　　AML细胞株U937与HL60由中国科学院广州生物医药与健康研究院赠予。STAT3抑制剂Stattic购于CAYMAN CHEMICAL公司，依托泊苷购于Sigma公司，药物均用二甲基亚砜（DMSO）溶解后于-20℃保存，使用时用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释为需要浓度。凋亡检测试剂盒、周期检测试剂盒购于南京凯基生物公司，γ-H2AX荧光标记抗体（抗体）购于Bio-Legend公司。采用BD公司C6和Calibur流式细胞仪及Berthold公司多功能酶标仪。
　　二、实验方法
　　1.细胞培养
　　U937和HL60细胞株复苏后，用RPMI1640细胞培养基+ 10%胎牛血清（美国Gibco公司）培养于5%二氧化碳、37℃细胞培养箱中，细胞密度维持在lx 105 -lx 106，2-3d更换培养基。
　　2.细胞活力检测
　　收集对数生长期的U937与HL60细胞株，调整细胞密度约为1×105/ml;将对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔100μl，药物组分别予1、2.5、5、10μM的Stattic处理，阴性对照组予DMSO处理，空白对照为培养基，每组设置3个重复孔;将培养板置于5%二氧化碳、37℃的培养箱培养24 h;向每孔加入10μl的细胞增殖一毒性检测试剂（ CCK8），将培养板在培养箱内孵育2h;用酶标仪测定在450 nm处的吸光度（OD）。增殖抑制率（%）=[1-（OD实验-OD空自组）/（0D阴性对照一OD空自组）]×100%
　　3.AML细胞周期的检测
　　采用不同浓度Stattic处理对数生长期U937与HL60细胞株24 h后收集各细胞样品，用PBS洗3次后去上清，加入500 μl 70%预冷乙醇固定2h，用PBS洗去固定液，加入500 μl PI/RNase A染色液（ PI：Rnase A=9：1），室温避光30 - 60 min，于Calibur流式细胞仪上检测，用Flowjo-VIO处理图像。
　　4.细胞凋亡的检测
　　采用不同浓度Stattic处理对数生长期U937与HL60细胞株24 h后收集各细胞样品，用预冷PBS（含2%胎牛血清）洗滌3次后用Bingdingbufferl00μl重悬，加5μl Annexin V-FITC和5μlPI，轻轻混匀，室温避光15 min。在BD公司C6流式细胞仪上测荧光强度，调节荧光补偿，用Flowjo-V10处理图像。
　　5.细胞DDR的相关检测
　　细胞DDR速度的检测：采用终浓度为6μg/ml的依托泊苷处理对数生长期U937与HL60细胞株，在细胞培养箱中培养2.5 h诱导DNA双链断裂。洗脱药物后加入新鲜培养基继续培养，分别培养0、2、4、6h后，收集各时间点细胞样品，用PBS洗涤3次后去上清，室温避光下用4%多聚甲醛重悬，静置15 min，用PBS洗去4%多聚甲醛后加入预冷的70%乙醇，将流式管放置于涡旋振荡器上，振荡混匀，-20℃下孵育60 min。用PBS洗去乙醇后重悬，加入5 μlγ -H2AX抗体，避光室温孵育90 min。Calibur流式细胞仪上检测荧光强度。Flowjo-V10处理图像并计算平均荧光强度（MFI）。 　　Stattic对细胞DNA双链断裂的影响：采用不同浓度Stattic处理对数生长期U937与HL60细胞株24 h后收集各细胞样品，用PBS洗涤，离心后用前述方法孵育γ-H2AX抗体，在Calibur流式细胞仪上测荧光强度，用Flowjo-V10处理图像并计算MFI。
　　Stattic对细胞DDR的影响：采用终浓度为6μg/ml的依托泊苷处理对数生长期U937与HL60细胞株，在细胞培养箱中培养2.5 h诱导DNA双链断裂。洗脱药物后，将各细胞株分为对照组与实验组，分别在含DMSO及2.5 μM Stattic的新鲜培养基中继续培养，6h后收集各细胞样品，离心后用前述方法孵育的γ-H2AX抗体在Calibur流式细胞仪上测荧光强度，Flowjo-VIO处理图像并计算MFI。
　　三、统计学处理
　　图像均采用Adobe Illustrator和GraphPad Prism处理，所有数据采用SPSS 19.0分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，2组均数比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果
　　一、Stattic抑制AML细胞增殖
　　CCK8检测显示，U937与HL60的增殖活性随着Stattic浓度的升高而减弱（P均<0.001），见表1。
　　二、Stattic促进AML细胞凋亡
　　1、2.5、5μM的Stattic均可诱导HL60细胞凋亡增加（P<0.001）;而U937仅在2.5、5μM浓度的Stattic处理后细胞凋亡才增加（P<0.001），n=3，见图1。2种AML细胞凋亡比率均随着Stattic药物浓度增大而增加。
　　三、Stattic阻滞AML细胞周期
　　各周期不同Stattic浓度组间比较中，U937：FSubGl=176.327， FG0/G1= 67.602， Fs= 43.302， FG2/M= 70.174; HL60： FSubGl=902.326， FG0/G1= 254.493，Fs= 470.447， FG2/M= 35.438.P均<0.001）。 2.5、5μM浓度的Stattic可将U937细胞周期阻滞在G2厂期（P<0.05），同时GO/G1期百分比下降（P<0.01）。l、2.5μM浓度的Stattic将HL60细胞周期阻滞在S期，同时G2/M期及G1/GO期百分比下降（P<0.05），HL60细胞在Stattic 5μM时，SubG1百分比升高，提示细胞凋亡较多。n=3，见图2。
　　四、AML细胞具有DNA双链断裂损伤修复能力
　　依托泊苷诱导U937与HL60细胞双链断裂后，U937与HL60γ-H2AX平均荧光水平均高于空白对照组，明确发生了DNA双链断裂。在随后的2、4、6h后，U937与HL60中的DNA双链断裂损伤得到了修复，表现为γ-H2AX荧光水平逐渐下降。n=3，见图3。
　　五、Stattic诱导AML细胞DNA双链断裂并阻碍其修复
　　HL60经不同浓度Stattic处理后均发生了DNA双链断裂，其程度随着药物浓度的增加而增大（F= 38.367.P<0.001）0 U937经2.5、5μM Stattic处理后也发生了DNA双链断裂（F=399.164，P< 0.001），但经1μM Stattic处理后也出现DNA双链断裂，但无前2组明显。经依托泊苷诱导DNA双链断裂后6h，Stattic处理后的U937与HL60细胞中γ-H2AX熒光强度仍维持在较高水平，提示Stattic阻碍了DNA双链断裂修复（t u937=199.7，P< 0.001;tHL60= 29.11，P<0.001）。以上实验结果均提示Stattic可以诱导AML细胞发生DNA双链断裂并阻碍其修复。
　　讨 论
　　1995年Yu等首次发现STAT3与肿瘤的发生与进展相关，目前，越来越多的研究证实了这个观点，70%的实体瘤和血液肿瘤具有STAT3活性增强的特性[13]。STAT3可以通过AKT/STAT3、Ras/Raf/MAPK、PI3K/AKT/mTOR通路促进白血病细胞增殖，同时，STAT3通路异常活化还会导致凋亡相关蛋白表达失衡[7，13]。
　　STAT3在白血病细胞的增殖中发挥重要作用[14]。Stattic属于非肽类STAT3小分子抑制剂，特异性地抑制STAT3 SH2结构域的功能，对STAT5、STATI几乎没有抑制作用，是STAT3抑制剂中特异性较好的小分子抑制剂。在本次实验中我们发现，经Stattic作用24 h后，AML细胞HL60及U937的细胞周期阻滞在S、G2/M期，抑制增殖，这与目前报道的抑制STAT3活性可以有效地抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖相符[13]。
　　STAT3的持续活化可抑制白血病细胞的凋亡，有研究者在FLT3-ITD突变的细胞株MV4-11中发现，p-STAT3的高表达导致抗凋亡基因Survivin表达上调，抑制细胞凋亡。在慢性淋巴细胞白血病细胞中，STAT3活化可上调抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL、Cyclin D1和ROR1表达，抑制细胞凋亡[7]。抑制STAT3的活性可调节凋亡相关蛋白的表达，促进白血病细胞的凋亡。在本实验中，Stattic能诱导AML细胞U937和HL60细胞凋亡，随着药物浓度增加，凋亡百分比增加。有研究显示，在HL60细胞中抑制STAT3活性可以上调促凋亡蛋白Caspase-3、P27和P21，同时降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达促进细胞凋亡[7]。然而，STAT3抑制剂对DDR的影响是否参与了白血病细胞的凋亡，目前尚无相关报道。 　　本实验显示AML细胞株U937和HL60在依托泊苷诱导DNA双链断裂后可对受损的DNA进行修复，而在加用Stattic后，DDR速度下降，这提示其可阻碍DDR，从而增加U937和HL60细胞对依托泊苷诱导DNA双链断裂的敏感性。Stattic单药作用24 h后可诱导U937和HL60细胞发生DNA双链断裂，并且DNA双链断裂水平也随着药物浓度升高而升高。所以Stattic可通过诱导DNA双链断裂并阻碍细胞对DNA双链断裂的修复，从而促进白血病细胞凋亡，增加白血病细胞对化学治疗药物依托泊苷的敏感性。许多传统化学治疗药物均通过诱导DNA损伤，最终诱导白血病细胞的凋亡。然而诱导DNA损伤的化学治疗药物也会激活DDR反应，且大部分肿瘤细胞具有较高的DNA修复能力，这是肿瘤细胞对化学治疗耐药的主要机制之一[15]。在A549人肺癌细胞株CD133+的肿瘤干细胞中DDR相关的基因表达上调，较强的DDR能力是肺癌干细胞难以清除的原因[16]。因此，阻碍DDR速度是目前突破化学治疗耐药的重要途径之一。在非小细胞肺癌中，奥斯替尼可降低肺癌细胞DDR速度，从而增加放射治疗或致DNA损伤化学治疗药物的敏感性，减低肿瘤细胞耐药率[17]。在白血病细胞中，西达本胺能够下调DNA修复相关基因，维持γ-H2AX水平以及增加细胞对蒽环类化学治疗药物的敏感性[18]。STAT3与DNA损伤修复密切相关，在敲除STAT3基因的小鼠胰腺B细胞中DNA损伤增加[9]。在食管癌及胶质母细胞瘤中均发现抑制STAT3活性可抑制DNA损伤修复，提高肿瘤对放射治疗及化学治疗的敏感性[10-11]。本实验也证实了在AML细胞中，STAT3抑制剂可阻碍DDR。
　　本实验初步证实Stattic可抑制AML细胞株U937和HL60的增殖，促进其凋亡。阻滞细胞周期于S、G2/M期及诱发DNA双链断裂、阻碍DDR是抑制增殖、促进凋亡的可能机制。Stattic通过影响哪些DNA修复通路抑制DDR需要进一步研究证明。
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