PD-L1在急性髓系白血病中的表达及临床意义

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　　摘要：目的  探究程序性死亡分子1配体-1（PD-L1）在急性髓系白血病（AML）中的表达作用和临床意义。方法  选取2013年1月～2016年12月在我院进行治疗并确诊为AML的初治患者49例为观察组，选择同期在我院接受治疗的27例非恶性疾病如缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血者作为对照组。对比两组患者血液中的PD-L1表达水平，分析患者性别、年龄、初诊白细胞计数、亚型的对血液中PD-L1的影响，确定PD-L1表达与临床疗效的相关性。结果  对照组患者治疗前的PD-L1表达与观察组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，观察组的PD-L1表达高于对照组，统计学意义显著（P<0.01）。单因素结果显示，PD-L1在AML初诊患者中的表达水平与患者的性别、年龄、初诊WBC数、分型无相关性（P>0.05）;未缓解AML患者组PD-L1表达水平高于持续完全缓解组AML患者（P<0.01）。结论  PD-L1可能参与AML的免疫逃逸机制，并可能与病情进展及治疗效果相关。
　　关键词：PD-L1;急性髓系白血病;免疫
　　中图分类号：R733.71                                 文献标识码：A                                DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.06.025
　　文章编号：1006-1959（2019）06-0079-03
　　Abstract：Objective  To investigate the expression and clinical significance of programmed death molecule 1 ligand-1 （PD-L1） in acute myeloid leukemia （AML）. Methods  From January 2013 to December 2016， 49 patients with initial diagnosis of AML were enrolled in our hospital. The observation group was selected from 27 non-malignant diseases such as iron deficiency anemia and giants treated in our hospital. A young cell anemia was used as a control group. The levels of PD-L1 in the blood of the two groups were compared. The effects of gender， age， white blood cell count， and subtype on PD-L1 in the blood were analyzed to determine the correlation between PD-L1 expression and clinical efficacy. Results  There was no significant difference in the expression of PD-L1 between the control group and the observation group （P>0.05）. After treatment， the expression of PD-L1 in the observation group was higher than that in the control group，the statistical significance was significant （P<0.01）. Univariate results showed that the expression level of PD-L1 in newly diagnosed patients with AML was not correlated with gender， age， number of newly diagnosed WBC， and type （P>0.05）. The expression of PD-L1 was higher in patients without AML. Patients with AML were continuously relieved （P<0.01）. Conclusion  PD-L1 may be involved in the immune escape mechanism of AML and may be related to the progression of the disease and the therapeutic effect.
　　Key words：PD-L1;Acute myeloid leukemia;Immunity
　　程序性死亡分子1配體-1（programmed death 1 ligand 1，PD-L1），又名B7同源分子1（B7 homologue 1，B7-H1）或CD274，是B7/CD28共刺激分子家族的重要成员，这一免疫标记近年来因与肿瘤发生发展密切相关而成为研究热点。PD-L1与程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）作为负性共刺激分子，两者结合后传递抑制性信号，降低淋巴细胞的免疫功能，削弱淋巴细胞的杀伤作用[1]。研究表明[2-6]，许多肿瘤细胞高表达PD-L1，如肺癌、肾癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等，其可与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1结合，限制抗肿瘤免疫应答，参与肿瘤免疫逃逸。但之前的研究大多关注于实体肿瘤，少量研究表明在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）等恶性血液系统疾病中PD-L1也存在高表达[2]。本研究检测急性髓系白血病患者的PD-L1的表达情况，探究其在急性髓系白血病中的临床意义。 　　1资料与方法
　　1.1一般资料  选取2013年1月～2016年12月天津市第一中心医院就诊，确诊为AML的初治患者49例为研究对象，作为观察组，排除急性早幼粒细胞白血病患者，所有患者均符合世界卫生组织（WHO）诊断分型标准[8]，其中M2 8例，M4 16例，M5 25例;男26例，女23例，年龄15～82岁，中位年龄54岁。选择同期在我院接受治疗的27例非恶性疾病如缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血者作为对照组，男13例，女14例，年龄15～83岁，中位年龄56岁。两组患者性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究通过本院伦理委员会批准，患者均已签署知情同意书并表示能够完成病例收集。
　　1.2试剂与仪器  Ficoll淋巴细胞分离液（天津川页生化制品有限公司）;Trizol试剂（Invitrogen，美国）;DEPC、氯仿、异丙醇、无水乙醇（天津化学试剂公司）;反转录试剂（Fermentas，美国）;Realtime试剂（Kapa，美国）;荧光定量PCR仪（Roche，瑞士）。
　　1.3方法  选用荧光定量PCR对PD-L1进行监测，包括引物设计、RNA提取、反转录和定量测定四个步骤。
　　1.3.1引物设计  使用Primer 5.0软件设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。
　　1.3.1骨髓单个核细胞的分离及RNA的提取  采集骨髓2～5 ml，EDTA抗凝，Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法收集单个核细胞。Trizol提取细胞总RNA，经紫外分光光度计测定浓度和纯度。
　　1.3.2反转录  反转录反应体系为Reverse Transcription预混液6 μl，Total RNA 14 μl，反应总体积20 μl。反转录反应条件为：25℃ 15 min，55℃ 40 min，85℃ 5 min。
　　1.3.3实时荧光SYBR Green相对定量PCR  将各模板cDNA在相同条件下进行相对定量PCR，反应体系为：2×KAPA SYBR FAST Mix 7.5 μl，Primer Mix（10 μmol/L）1 μl，cDNA（10 ng）1 μl，DEPC H2O 5.5 μl，反应总体积15 μl。实时荧光相对定量PCR扩增条件为：先95℃ 30 s，后95℃ 3 s，60℃ 30 s循环40次。数据由LightCycler96系统软件依样本荧光值自动计算得出样本中感兴趣的目标基因和内参基因的相对表达水平，并将最终结果表示为这些基因的比例，比例=目标（目的基因PD-L1）浓度/参考（内参基因β-actin）浓度。
　　1.4观察指标  对比两组患者治疗前后的PD-L1表达水平，对比分析不同性别、年龄、WBC、亚型的AML患者PD-L1表达水平，以及不同疗效情况下的患者的PD-L1表达差异。
　　1.5统计学方法  采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以（%）表示，采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学意义显著。
　　2结果
　　2.1观察组临床疗效  观察组患者中，9例未接受化疗，20例经1～2次诱导化疗获得完全缓解，并持续1.5年以上，15例经2次或以上诱导化疗未达到完全缓解，5例为诱导化疗缓解后再复发患者，临床有效率为40.82%（20/49）。
　　2.2两组治疗前后PD-L1 mRNA表达比较  两组患者治疗前的PD-L1表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，观察组的PD-L1表达高于对照组，统计学意义显著（P<0.01），见表2。
　　2.3观察组PD-L1 mRNA表达的影响因素  观察组患者在初诊治疗前，男性与女性PD-L1表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;以年龄60岁为界，观察组患者初诊治疗前≥60岁和<60岁的PD-L1表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）;以白细胞计数30×109/L为界，观察组患者初诊治疗前≥30×109/L和<30×109/L的PD-L1表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）;在初诊治疗前各亚型患者PD-L1表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。初诊治疗前，持续完全缓解、未缓解、复发患者的PD-L1表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）;其中，未缓解患者PD-L1表达水平高于持续完全缓解患者，统计学意义显著（P<0.01），见表3。
　　3討论
　　随着诊断水平的提高，化疗方案的不断改进、靶向药物以及造血干细胞移植等治疗手段的广泛应用，血液系统恶性肿瘤的诊治水平得到了很大的提高，使患者的预后有了较大改善，但仍有部分患者因原发耐药或缓解后复发导致死亡。近几年发现，多种肿瘤细胞表面高表达PD-L1，对PD-L1参与肿瘤免疫逃逸及利用PD-L1进行免疫治疗的相关研究己成为目前国内外肿瘤学研究的热点，但之前的研究多关注于PD-L1在实体肿瘤中的表达及作用，PD-L1/PD-1信号通路在实体肿瘤中的免疫负调控作用已得到广泛的证实，而关于其在急性髓系白血病等血液系统恶性肿瘤中的表达及临床意义则报道较少。
　　AML原始细胞抑制T细胞功能，但这一途径的确切性质目前并不清楚，B7家族分子可能是这种免疫抑制效应的原因之一。有文献报道小鼠AML模型中，肿瘤的进展导致调节T细胞的增强和CD8细胞毒性T细胞上PD-1表达的增强，PD-1/PD-L1相互作用促进调节T介导的对T效应细胞的抑制，从而抑制抗肿瘤免疫应答[7，8]。miRNA（miR）34a可在肿瘤发生中调节关键基因的转录，Kasumi-1细胞miR-34a过表达可抑制PD-L1的表达[9]，以上动物模型及细胞实验提示PD-L1可能在AML的免疫逃逸机制中也发挥作用，从而有可能与AML的治疗效果和预后相关。本次研究结果显示，观察组患者PD-L1表达水平高于对照组，未缓解患者初治时PD-L1表达水平最高，其次为复发患者，而持续完全缓解的患者表达水平最低，这与马红等[10]研究结果一致，提示PD-L1表达水平可能与AML疗效相关，PD-L1表达水平高者治疗更为困难，可能与化疗失败相关。另外，PD-L1在初诊治疗前AML患者中的表达水平与患者性别、年龄、初诊WBC数、分型并无相关性，提示PD-L1可能是影响AML疗效的独立因素。 　　大量研究已表明，PD-L1/PD-1信号通路在削弱抗肿瘤免疫应答方面发挥重要作用[11-14]，靶向这一途径的检查点治疗，如在多种实体瘤的挽救治疗中取得良好疗效的PD-1抗体Nivolumab、Pembrolizumab及PD-L1抗体BMS-936559、MEDI4736已取得突破性进展，其在恶性血液病中也逐渐崭露头角，有望联手化疗、造血干细胞移植等，成为未来急性髓系白血病等血液系统恶性肿瘤免疫治疗的新靶点。
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　　收稿日期：2018-12-15;修回日期：2018-12-25
　　编辑/王海静
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