干旱胁迫下的小麦LEA蛋白组学表达模式分析
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摘要：小麦是世界重要的粮食作物，利用差异蛋白质组学技术研究小麦对干旱胁迫的响应机理，有助于整体揭示小麦干旱应答的遗传基础。为研究干旱胁迫对小麦子粒灌浆期蛋白表达的影响，采用双向电泳分析干旱脅迫与正常条件下成熟子粒清蛋白表达谱的差异，干旱胁迫后，小麦子粒出现130个差异蛋白质点，成功鉴定出57个差异蛋白，特异表达7个，涉及ATP-葡萄糖焦磷酸化酶、过氧化还原酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂等13种蛋白质，能量类2个，病害防御相关17个，功能未知蛋白21个。
关键词：小麦;干旱胁迫;蛋白组表达
中图分类号：S-3
文献标识码：A
DOI：10.19754/j.nyyjs.20191115009
我国小麦播种区大多处于干旱半干旱区，小麦基因受到激活产生干旱胁迫蛋白，维持个体存活，小麦抗旱品种抽穗期水分胁迫后产生低分子量的D-答应蛋白，与品种的抗旱性密切相关。蛋白质在植物细胞适应胁迫中起到重要作用，蛋白质作用表现为羟基自由基清除剂，细胞内酶的保护剂及降低细胞内酸度等，利用15%PEG-600高渗溶液模拟干旱胁迫条件，比较分析小麦幼苗蛋白质含量，为小麦抗旱种质资源筛选提供理论依据。
1 已有研究综述
我国北方小麦生育期平均降水量不足2000mm，植物为生存不断适应环境，其生理反应随之发生系列改变，蛋白质在小麦适应干旱胁迫生命活动中具有重要的作用，探究小麦蛋白含量指标对干旱的响应程度，对选育优良抗旱性能的小麦具有实际意义。
干旱胁迫影响粒子碳水化合物的合成，影响小麦产量，春小麦生长时期遭遇干旱胁迫烘烤品质会变劣。冬小麦干旱胁迫使粒子蛋白质含量不同程度提高，但导致蛋白质产量下降。干旱促进小麦粒子清蛋白与球蛋白在灌浆初期积累，干旱严重时会降低蛋白质含量。有关干旱对小麦粒子总蛋白质含量的研究报道较多，针对小麦粒子蛋白质组学的研究较少[1]。
Shapiro等人在1967年发现SDS-聚丙烯酰胺凝胶电，是生物化学领域广泛使用的易于操作的测定蛋白质相对分子量的方法，SDS电负荷量大大超过蛋白质分子电荷量，与其结合的多肽链带均匀负电荷，所有SDS-蛋白复合体在电泳时以相同的Q/M值正向移动，SDS-蛋白复合体在水溶液中形状为长椭圆棒，蛋白质分子电泳迁移率主要取决于其相对分子量。
比较蛋白谱中蛋白条带染色深浅等，得出各组小麦蛋白的差异。蛋白质是生命活动的直接载体，小麦的根在不同环境中有明显的变化，对小麦根部蛋白质研究有重要意义。聚乙二醇是具有渗透调节功能的生物大分子，以晋麦47号为实验材料，对小麦3叶期幼苗进行处理，使小麦根部在缺水条件下16h后，采用尿素提取蛋白，对小麦幼苗根系蛋白质进行分析。
2 实验研究
2.1 实验方法
实验以优质强筋小麦品种为材料，将小麦种子播种于40cm×50cm塑料盒中，播深3cm，株间距5cm，待开花后移入人工气候室，生长温度夜晚12℃，对照组土壤含水量为20%，干旱组土壤含水量为7%～12%，收取成熟粒子用于蛋白组学分析。
将收获子粒磨成面粉，称取50mg面粉放入1.5mL离心管，离心管置于冰上搅拌5min，取200μL上清液，加入1.2mL甲醇醋酸铵溶液，过夜沉淀蛋白质。次日4℃离心10min，加入800μL预冷丙酮，清洗沉淀，离心5min，真空离心干燥40min，室温震荡溶解1h，吸取上清蛋白溶液，蛋白质含量测定采用Bradford法。
用500μL上样水化液在重泡胀IPG胶条，第1向固相PH梯度等电聚焦，等电聚焦电压参数设置150V，1.5h，500V1.0h，线性上升到800V4500Vh。聚焦结束后将胶条转入平衡管，平衡母液配方0.05mol/L，Tris-HCl，0.3g/ml甘油。配制后分小瓶分装，取配好的平衡母液15mL，加入乙酰胺配置成平衡液。
向SDS-PAGE垂直板电泳，用0.5%低熔点琼脂糖封顶，胶板置于Ettan Dalt six。连接好电泳仪与控温循环水浴进行第2向变性胶电泳。15w/胶4h.银染采用Plus One Silver Staining Kit方法，用固定液固定30min，用敏化液敏化30min，蒸馏水洗3遍，快速水洗胶两面加显色液显色，用1.5%EDTA-Na终止反应10min，清洗干净的胶用扫描仪扫描，于4℃保存。
用EPSON p4990扫描仪进行图像扫描，蛋白点自动检测，将胶与参比胶进行自动匹配。手动挖出差异蛋白点，将30mol/L铁氟化钾与100mol/L硫带硫酸钠1：1混合，蛋白点脱色完全水洗3遍终止反应。50%乙腈清洗胶块，真空干燥胶块20min，加入质谱级胰蛋白酶，4℃吸胀40min后用25mol/L碳酸氢铵覆盖胶块，冷冻干燥2h，-80℃待质谱测定。
使用AB SCIEX MALDI 5800 Analyzer进行肽指纹图谱测定，取0.8μL酞溶液，溶于30%乙腈，混合用于质谱分析。缝图分析软件为GPS Explorer TM3.6.采用Mascot软件在NCBLnr库中进行匹配，选择甲硫酸氧化作为可变与固定修饰。
2.2 结果分析
在粒子清蛋白与球蛋白双向电泳图谱中鉴定出蛋白点，第1维电泳采用24cmPH4-7的IPG胶条，通过Image Master软件分析发现蛋白质点符合t检测。
成功鉴定出的57个差异蛋白点，涉及13种蛋白质，28%的蛋白点参与不同生化的酶，包括球蛋白、二硫键异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂，同种蛋白酶蛋白点具有相同的等电点。可能由于RNA可变剪切引起，修饰会改变蛋白质的分子量，可能存在多个同源基因。
干旱胁迫后上调表达的蛋白质包括β-淀粉酶、过氧化还原酶、球蛋白、二硫键异构酶、葡萄糖与核糖醇脱氢酶。干旱胁迫后下调表达蛋白质有丝氨酸蛋白酶抑制剂，干旱胁迫后特异表达的蛋白质包括真核生活转录起始因子5Al与球蛋白。对照表达的蛋白点包括果糖二磷酸缩醛酶，一些同类，能量类，疾病防御相关与转录。功能未知蛋白有21个，代谢类有10个，蛋白质加工有6个，疾病预防相关有17个。 3 讨论
在干旱胁迫下，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、果糖-1，与能量代謝有关的酶类会发生上调或下调表达。满足细胞抗逆胁迫的物质与能量需要。β-淀粉酶可水解淀粉生成麦芽糖，具有保护蛋白质的功能。
检测到的13个胁迫相关蛋白为丝氨酸蛋白酶抑制剂，上调表达3个，L10，L21具有相同的等电子与不同的分子量，L37，L40具有相同的分析量与不同的等电子。丝氨酸蛋白酶抑制剂在植物中含量约为3～4mg/g，普通小麦中鉴定6种不同丝氨酸蛋白酶抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制剂主要抑制丝氨酸蛋白酶类，普通小麦在高温胁迫下，表现出丝氨酸蛋白酶抑制剂上调现象，在干旱胁迫下游10个下调表达的蛋白点鉴定为丝氨酸蛋白酶抑制剂。在多种环境下胁迫中发生差异表达。
在干旱处理中检测到α-淀粉酶抑制剂上调表达，在硬粒小麦高温胁迫研究中发现α淀粉酶抑制剂发生差异表达，α淀粉酶抑制剂在非生物逆境中作用不清楚。
Cor蛋白质是响应冷胁迫的蛋白质，WCOR18编码165氨基酸的高亲水蛋白质，研究表明WCOR18可能参与到多种胁迫应答中，小麦在苗期干旱胁迫下超氧化物歧化酶上调表达，在粒子发育后期能增加粒子的耐脱水性，保证种子在恶劣环境条件下不萌发。
储藏蛋白的变化主要是球蛋白家族，干旱中有1个特异表达的蛋白点鉴定为二硫键异构酶，其功能是催化蛋白质检形成二硫键。二硫键上调表达可能为修复蛋白质折叠错误，可能在干旱胁迫应答中扮演重要的角色。
4 结语
实验研究干旱胁迫处理对小麦根部蛋白表达的作用，发现不同时间的干旱处理对小麦根部蛋白影响不同，实验中遇到很多难题，经不断改善实验操作顺利完成，实验过程中要注意问题的严格把控，包括离心、研磨等，处理样品时尽量缩短时间减少步骤，实验采用尿素法，较直接提取法提取的蛋白量多，符合电泳样品的标准，在蛋白提取中加1次丙酮纯化蛋白，使用蛋白裂解代替传统方法中的水，减少了误差。制好的胶放在缓冲液中保存，使胶凝固充分，制胶与点样时不能有气泡。
作物干旱逆境条件下产生生理反应为多方面，不同品种小麦在同样干旱胁迫下，抗旱性强的小麦品种干旱逆境下变化较小，研究选取的品种具有较强的抗旱性，开麦18幼苗蛋白质含量变化率较大，可能幼苗蛋白表达受到影响。干旱胁迫下与对照组品种小麦幼苗蛋白质变化显著。金麦8号品种可作为抗旱品种利用。
参考文献
[1] 卢云泽. 小麦灌浆期旗叶响应高温胁迫的蛋白组学与热响应关键基因HSP90的全基因组分析[D].杨凌：西北农林科技大学，2018.
作者简介：
白建瑞（1978-），女，本科，讲师。研究方向：生物学。
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