二十五种中草药对烟草普通花叶病毒病的防治效果

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　　摘   要   烟草普通花叶病毒病在云南省玉溪烟区发生日趋严重，影响烟叶产量和品质，威胁玉溪烟草生产，目前尚无一种较为理想的防治药剂。试验测定了25种中草药在普通烟品种K326上对烟草普通花叶病毒病的防治效果及对烟叶中丙二醛、类黄酮和总酚含量的影响。结果表明：烟株接种烟草普通花叶病毒24 h后，分别喷25种中草药的粗提物200倍液，14 d后，烟叶中丙二醛的含量显著低于清水对照，类黄酮和总酚的含量显著高于对照;对烟草花叶病的防效较好的是射干、柴胡、五倍子和虎杖，防治效果分别为57.95%、53.33%、50.26%和48.72%。
　　关键词    中草药;烟草;普通花叶病毒;防治效果
　　中图分类号：S435.72    文献标志码：A    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.1.006
　　烟草普通花叶病毒病是一种在世界各烟区广泛分布、局部地区严重流行的烟草病害，在我国各产烟区普遍发生[1]。近年来，云南省玉溪烟区普通花叶病毒病发生日趋严重，且有不断上升趋势，严重影响了烟叶的产量和品质，威胁玉溪烟草生产。前人对烟草花叶病毒病的防治做了一些研究，但由于病毒扩散、传播方式特殊，与寄主的寄生关系和复制（增殖）方式复杂及农药自身的特性等，迄今為止尚无一种较为理想的防治药剂[2]。中草药的应用在我国有着古老的历史，在人、畜病毒病的防治中发挥着重要作用[3]。从植物中筛选抗病毒物质是开发植物抗病毒抑制剂的重要途径之一[4]。本研究旨在筛选能有效防治烟草花叶病毒病的中草药，为烟草花叶病毒病防治探索新的途径[5]。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　供试中草药：供试的25种中草药（见表1），购自玉溪市一心堂药店，厂家为云南鸿翔药业。
　　供试作物：普通烟（Nicotiana tabacum L.），品种为K326（玉溪中烟种子有限公司生产）。漂浮育苗，于6～7叶时进行盆栽。
　　供试毒源：供试毒源Tobacco mosaic virus（TMV）保存在普通烟上。采用常规汁液摩擦法接种。病毒接种液由病叶和PBS缓冲液按1∶20（w/v）的比例加少量金刚砂研磨后，用4层纱布过滤所得[6-7]。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 中草药粗提物的制备
　　用中药粉碎机将中草药粉碎成粉末，在室温下加入样品量6倍的分析甲醇（V/M），浸泡72 h，期间不断搅拌，使其充分溶解，用漏斗过滤后，蒸发浓缩获得膏状提取物，置于4 ℃冰箱保存[8]。
　　1.2.2 接种
　　烟株盆栽10 d后接种病毒，采用常规汁液摩擦法接种。接种后用清水冲洗，24 h后喷中草药粗提物200倍液，对照喷清水。试验设26个处理，每种药剂为1个处理，以清水为对照，每处理重复3次，每次重复20株。
　　1.2.3 病情调查
　　接种14 d后调查各处理烟株的发病率和病情指数，计算防治效果。病害分级与调查方法按照国标GB/T 23222-2008《烟草病虫害分级及调查方法》进行，以株为单位，分为：0级，全株无病;1级，心叶脉明或轻微花叶，病株无明显矮化;3级，1/3叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上;5级，1/3至1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的2/3至3/4;7级，1/2至2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2至2/3;9级，全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的1/2以上[9]。发病率、病情指数、防治效果计算公式如下：
　　发病率=（发病株数/调查总株数）×100%
　　病情指数=[∑（各级病株×该病级值）/（调查总病株×最高级值）]×100
　　防治效果=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数]×100%
　　1.2.4 烟株生理指标的测定
　　病情调查后，取样测定烟叶的丙二醛、类黄酮和总酚含量。
　　1.2.4.1丙二醛（MAD）测定
　　丙二醛（MAD）含量的测定采用硫代巴比妥酸法[10-11]，具体过程为：称取各处理新鲜叶片0.5 g，加入5%三氯乙酸（TCA）5 mL，研磨后所得匀浆在3 000 r·min-1下离心10 min，取上清液2 mL，加入0.67%硫代巴比妥酸（TBA）2 mL，混合后在100 ℃水浴上煮沸30 min，冷却后再离心一次，最后以0.67%硫代巴比妥酸（TBA）溶液为对照，分别测定上清液在450 nm、532 nm、600 nm处的吸光度值，并按公式算出MDA浓度，再算出单位鲜量组织中的MDA含量（nmol·g-1）。
　　C（μmol·L-1）=6.45（A532-A600）-0.56A450
　　1.2.4.2类黄酮、总酚含量测定
　　类黄酮、总酚含量的测定参照余清等[12-15]的方法进行。具体过程为：用电子天平称取0.500 g新鲜叶片，剪1～2 mm的小块，加1%HCl的甲醇溶液5 mL提取24 h（4 ℃），取0.5 mL提取液用蒸馏水稀释至25 mL，测定OD280和OD325，类黄酮含量以OD325/g鲜重表示，总酚含量以OD280/g鲜重表示。
　　1.3 数据处理
　　试验数据采用Excel 2007进行数据统计，DPS7.0分析软件进行显著性测验，Duncan’s新复极差法进行多重比较。
　　2 结果与分析
　　2.1 25种中草药对烟草普通花叶病的防治效果
　　喷药14 d后调查各处理烟株的发病情况，计算病情指数和防治效果，结果见表2。由表2可见，防治效果最好的是射干，防效达57.95%;其次是柴胡、五倍子和虎杖，防效分别为53.33%、50.26%和48.72%;再次是连翘、贝母、玄参、夏枯草，防效分别为44.61%、43.59%、41.54%、41.54%;甘草、黄连、佩兰、苦杏仁、桔梗、槐花、板兰根和地榆的防效在30.26%～39.49%;其余处理的防效都低于30%。 　　2.2 25种中草药对烟叶丙二醛含量的影响
　　测定各处理烟叶的丙二醛含量，结果表明（见表3），对照烟叶的丙二醛含量最高，达13.83 nmol·g-1;最低的是射干，烟叶丙二醛含量为7.58 nmol·g-1;枙子、黄花、黄岑、知母、牡丹皮、地黄、鱼腥草、薄荷、板兰根、地榆、淡竹叶、槐花、桔梗处理的烟叶丙二醛含量高于10 nmol·g-1;其余处理的烟叶丙二醛含量都低于10 nmol·g-1。
　　2.3 25种中草药对烟叶类黄酮含量的影响
　　测定各处理烟株烟叶内类黄酮的含量，结果表明（见表3），对照处理的烟株中类黄酮含量最低，为0.501 OD325/g;枙子、黄花、黄岑、知母处理的烟株类黄酮含量低于1.000 OD325/g;其余处理的烟株烟叶类黄酮含量均高于1.000 OD325/g，其中射干处理的烟株烟叶类黄酮含量最高，达1.553 OD325/g。
　　2.4 25种中草药对烟叶总酚含量的影响
　　测定各处理烟叶的总酚含量，结果表明（见表3），射干处理的烟叶总酚含量最高，达1.779 OD280/g;对照处理的烟叶总酚含量最低，为0.567 OD280/g;射干、五倍子、虎杖、连翘、贝母、夏枯草、黄连、苦杏仁、佩兰、柴胡、玄参、桔梗、淡竹叶、地榆、槐花和板兰根处理的烟叶总酚含量高于1.000 OD280/g。
　　3 结论与讨论
　　试验结果表明，烟株接种普通花叶病毒24 h后，分别喷25种中草药的粗提物200倍液，7 d后，25种中草药处理的烟叶中丙二醛含量显著低于清水对照，类黄酮和总酚含量显著高于对照;其中对烟草花葉病的防效较好的是射干（防效达57.95%）、柴胡（防效达53.33%）、五倍子（防效达50.26%）、虎杖（防效达48.72%）。
　　MDA含量作为细胞膜损伤程度的生理指标和膜质过氧化指标，反映了细胞质过氧化程度和植物对逆境条件的反应强弱[15-16]，总酚和类黄酮含量与植物抗病性关系密切[17-21]。本研究中射干、柴胡、五倍子、虎杖等中草药能降低烟叶中丙二醛含量，提高烟叶类黄酮、总酚含量，从而增强烟草的抗病性，但其对烟草的抗病活性物质和抗病机理还有待进一步研究。
　　植物病毒病有“植物癌症”之称，目前还没有一种植物病毒病的理想防治药剂[22]。中草药中普遍存在生物碱类、苷类、有机酸、黄酮类、氨基酸、挥发油、酚、醛、鞣质、多糖和单糖等抗病毒物质[23]，这些物质易在植物体内运输，在环境中易被降解，不易造成环境污染和残留问题。刘学端等[24]利用商陆、甘草、连翘等几种中草药复配成MH11-4可湿性粉剂能明显抑制植物体内TMV的增殖。刘华山等[25]研究3种中草药对烟草普通花叶病有一定的防效。本试验结果表明，射干、柴胡、五倍子对普通烟K326烟草花叶病的防效高于50%。我国中草药资源丰富，在进行抗病毒活性中草药的筛选时，要充分扩大筛选范围，有利于从中发现高活性中草药，由此开发出高效植物抗病毒抑制剂。
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　　（责任编辑：易  婧）
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