桔梗根腐病病原鉴定及防治药剂筛选初报

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　　摘   要   对桔梗根腐病症状观察、病原菌分离、病原菌形态观察及接菌和再分离，桔梗根腐病病原鉴定为镰刀菌。同时采用室内生长速率法比较了15种杀菌剂对桔梗根腐病的毒力作用。结果表明，不同杀菌剂在抑制菌丝生长程度上存在差异，其中10%氟吗啉·50%代森锰锌WP对桔梗根腐病菌菌丝生长有明显的抑制效果，其 EC50值为0.000 12 μg·mL-1;50%多菌灵WP对桔梗根腐病病菌菌丝的生长抑制效果较好，其EC50值为0.205 01μg·mL-1，以上这两种药剂可作为桔梗根腐病田间药效试验的首选药剂。其他药剂如百菌清、凯润、嘧菌脂、代森锰锌和瑞对桔梗根腐病病菌菌丝生长的抑制效果差。
　　关键词    桔梗;镰刀菌;病原形态;生长速率法;EC50
　　中图分类号：S435.672    文献标志码：A    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.1.007
　　桔梗（Platycodon grandiforus），是桔梗科（Campanulaceae）桔梗属（Platycodon）的一种多年生草本植物。桔梗也叫铃铛花、白药、土人参等，以根入药，除药用外，还可以用于酿酒、菜食及作为观赏花卉栽培。桔梗味苦、辛，性平[1]。主要分布于中国、朝鲜半岛、日本和西伯利亚东部。桔梗体内有乳汁，全株光滑无毛。根粗大肉质，圆锥形或有分叉，外皮黄褐色。茎直立，有分枝;叶多为互生，少数对生，近无柄，叶片卵形或卵状披针形，边缘有锯齿;花大型，蓝紫色或蓝白[2]。朝鲜族人把桔梗的根用作野菜食用，有宣肺、利咽、祛痰、排脓功效。现代医学研究表明，桔梗还有降血糖、降血脂、镇静、镇痛、解热、扩张血管、减慢心率、抗溃疡等功效。
　　病害严重一直是影响桔梗产量的主要因素。据调查，桔梗病害主要有两大类，一类是茎叶上的病害，主要有轮纹病（Ascochyta.sp）、斑枯病（Septiria platycodonis Sdy.）、炭疽病（Colletotrichum sp.）;另一类是根部病害，主要有立枯病（Rhizoctonia solani）、枯萎病（Fusarium）、根腐病（Fusarium sp.）、紫紋羽病菌（Helicobasidium mompa Tanaka）、根结线虫病（Meloidoyne incognite）等[3]。其中根部病害是影响桔梗产量的主要病害，危害程度不容忽视。
　　近年来，根腐病已经成为影响桔梗生产的主要病害之一，但生产中仍然有很多人对其认识不足、重视不够，往往错过最佳防治时机，使病害难以得到有效防控。因此，迫切需要寻找高效、低毒、低残留的药剂来进行防治。本试验对吉林农业大学药植园中的患病桔梗进行病原菌的分离和鉴定，并做了大量的室内药剂筛选工作，以期筛选出对桔梗病害防效好、安全环保、不影响桔梗产量和品质的农药种类，为生产上科学用药提供依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 病害症状描述
　　2018年7月，在吉林农业大学植物园发现桔梗根腐病发生非常严重，尤其是在地势低洼地的桔梗根腐病发病率将近100%。
　　1.2 病原菌分离与纯化
　　组织分离法对在吉林农业大学药园采集到的桔梗进行分离，用刀片切取病健交界处病组织若干块，大小为2 mm×2 mm，放在0.1%升汞中消毒0.5 min，再用无菌水冲洗3次，置于PDA培养基上，每皿2～4块，在25 ℃恒温培养箱下培养。
　　PDA培养基配方：马铃薯200 g、葡萄糖18 g、琼脂16 g、蒸馏水1 000 mL。
　　将在平板培养基上分离出的菌丝连同培养基一起挑出，移植到另一PDA培养基上继续培养。
　　1.3 病原菌致病性测定
　　采用伤口接种法，将保存的待试菌株接种到PDA平板上活化，25 ℃下培养。7 d后，用无菌水将健康桔梗茎（根）冲洗干净，用刀片割伤桔梗茎（根）。将PDA上的菌种分成大小均等的四块菌饼，用无菌水将脱脂棉湿润，将菌饼放入脱脂棉中，用透明膜将脱脂棉包在桔梗伤口处（注意用菌饼对准伤口），以无菌水接种健康桔梗茎（根）为对照，每隔3天观察一次，并记录发病情况。
　　1.4 病原菌形态学鉴定
　　对接种发病的菌株进行形态学观察，包括对病原菌在培养基上形成的菌落形态、色泽。观察病原菌分生孢子的大小、形态，并做好记录。
　　1.5 室内药剂筛选
　　供试菌种为分离获得的病原菌。供试杀菌剂有15种，其药剂名称、有效成分、生产单位详见表1。
　　1.5.1 试验方法
　　采用生长速率法进行测定，在灭菌融化并冷却到40～50 ℃的9 mL PDA 培养基中加入1 mL药液，摇匀注入直径 90 mm的培养皿中制成含毒平板。对照处理加入1 mL灭菌水。每种药剂按高浓度到低浓度（1×104 mg·L-1、1×103 mg·L-1、1×102 mg·L-1、10 mg·L-1、1 mg·L-1、0.1 mg·L-1）顺序，每个处理设3次重复。带药平板静置冷却后，将试验前3 d扩繁的根腐病菌平板，用打孔器打成直径为 8 mm的菌饼置于含药平板中，每皿3块菌饼，均匀放置，置于25 ℃恒温箱中培养，待培养72 h后用十字交叉法测量菌落直径，并做记录。
　　1.5.2 计算方法
　　根据公式：抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌碟原始直径）×100;求出生长抑制率，将其换算成几率值，药剂浓度取对数值，建立“浓度对数-几率值”直线方程，即y=a+bx（y为几率值，x为稀释倍数的对数）。进行相关显著性分析，根据直线回归方程，当取y=5时，求得的x值的负对数即为EC50的值，比较病原菌对各种药剂的敏感程度。 　　2 结果与分析
　　2.1 病害症状描述
　　该病菌主要为害桔梗根部，发病初期在近地面的根头部位出现褐色坏死，逐渐向下蔓延，15～20 d即可引起全根壞死，后因腐生菌侵入，导致坏死组织软腐分解，仅残留外皮[4];同时地上部茎叶逐渐变黄，此时茎内导管并不变色。当整个肉质根变褐坏死，地上部茎、叶也萎蔫死亡。
　　2.2 菌种纯化培养
　　用组织分离法获得纯化菌株在PDA培养基上培养，使用时转至PDA平板培养基上活化。
　　2.3 致病性测定
　　用伤口法接种7 d后均开始发病，呈褐色病斑，与自然发病病斑相比颜色较浅。对照茎（根）未见发病，从以上接种的发病茎（根）再分离的病菌与原接种菌株相同，因此证实原接种菌株为致病菌（见图1）。
　　2.4 病原菌形态学鉴定
　　在PDA平板上培养，菌落突起絮状，菌丝白色质密。菌落初期为白色，后期产生色素，呈粉白色、浅粉色，略带有紫色。小型分生孢子单细胞，椭圆形至卵圆形，分生孢子大小（5.04～15.93） μm×（1.64～6.06） μm;大型分生孢子镰刀形，少许弯曲，分生孢子大小（24.39～44.54） μm×（3.26～7.31） μm，多数为三个隔膜，少数有1～2个隔膜，鉴定为尖孢镰刀菌（F.oxysporum）（见图2、图3）。
　　2.5 室内药剂筛选结果
　　根据供试菌碟在含毒平板上菌落直径的大小计算抑制率，求得各药剂对病菌的毒力回归方程及EC50见表2。由表2可知，300亿/g蜡质芽孢杆菌WP、50%多菌灵WP、30%氟菌唑WP对桔梗根腐病菌菌丝生长的抑制效果最好，其EC50值0.000 121、0.205 011、
　　1.359 245 μg·mL-1;10%氟吗啉·50%代森锰锌WP、1×106 cfu/g寡雄腐霉WP、10%苯醚甲环唑WG对桔梗根腐病菌菌丝抑制效果较好，其EC50值分别为5.766 748、6.751 321、8.040 113 μg·mL-1，以上这几种药剂是防治桔梗根腐病的首选药剂;其次10%多抗霉素BWP、40%氟硅唑EC、1亿/g枯草芽孢杆菌WP、25%丙环唑EC没有明显的抑制效果;250 g·L-1吡唑醚菌酯EC、250 g·L-1嘧菌酯SC、70%代森锰锌WP、50%嘧菌环胺WG对桔梗根腐病病菌几乎没有抑制效果。
　　3 结论与讨论
　　试验结果表明，引起桔梗根腐病的病原菌是尖孢镰刀菌。15种药剂对桔梗根腐病病菌的室内毒力测定结果表明，300亿/g蜡质芽孢杆菌WP、50%多菌灵WP、30%氟菌唑WP对桔梗根腐病菌菌丝生长的抑制效果最好，10%氟吗啉·50%代森锰锌WP、1×106 cfu /g寡雄腐霉WP、10%苯醚甲环唑WG对桔梗根腐病菌菌丝的抑制效果较好，以上几种药剂可作为桔梗根腐病田间药效试验的首选药剂;而10%多抗霉素BWP、40%氟硅唑EC、1亿/g枯草芽孢杆菌WP、25%丙环唑EC没有明显的抑制效果，250 g·L-1吡唑醚菌酯EC、250 g·L-1嘧菌酯SC、70%代森锰锌WP、50%嘧菌环胺WG对桔梗根腐病病菌菌丝几乎没有抑制效果。
　　本试验结果表明：300亿/g蜡质芽孢杆菌WP对桔梗根腐病病菌菌丝生长的抑制效果最好，其相关研究尚未见报道。50%多菌灵WP对桔梗根腐病病菌菌丝抑制效果较好，与朱京斌等用多菌灵蘸根对桔梗根腐病的防治效果很好的研究结果[5]相一致。本研究为杀菌剂的室内毒力测定，还需进行田间药效试验来确定药剂稀释浓度。“绿亨一号”“绿亨二号”是目前较先进的新型内吸杀菌剂，性能稳定，安全可靠，是防治土传病害的理想药剂，可大面积推广应用[6]。
　　笔者认为，本试验筛选出了300亿/g蜡质芽孢杆菌WP是防治桔梗根腐病的首选药剂，可以在大田试验中推广应用。目前，大多数研究者认为多菌灵是防治根腐病的首选药剂[7-9]。长期使用某种药剂会使病原菌产生抗药性，因此药剂的轮换使用是十分必要的。药剂防治多少都会对环境造成污染，需要我们继续研究高效的生物防治技术，以减少对环境的污染。采取一定的农业防治也是有必要的[10]，忌连作，最好是与禾本科作物轮作;要及时防治地下害虫[11]，因为地下害虫对植物造成的伤口往往使病菌有机可乘，也是植物发病的主要原因之一。
　　药剂对病菌的EC50值并不能完全代表该药剂的田间防治效果，如果单纯根据室内毒力测定结果来判断杀菌剂的抑菌效果，往往让室内抑菌效果差的药剂过早被淘汰，失去进入田间药效试验的机会，这与刘峰等的观点一致[12]，因此需要根据进一步的田间药效试验结果来确定理想药剂。
　　
　　参考文献：
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　　[12] 刘峰，慕卫，张文吉，等.杀菌剂对水稻旱育秧立枯病的控制作用及其对秧苗的生理效应[J].农药学学报，2004，6（2）：37-42.
　　（责任编辑：易  婧）
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