短肽HFDT1对MFC荷瘤小鼠抗肿瘤作用的初步代谢组学研究

来源:用户上传      作者:王雪雪 常旭 欧红利 江伦 陶柱萍 厉颖 张成桂 刘卫红 高鹏飞 白丽

　　摘要  [目的]比較分析短肽HFDT1对MFC荷瘤小鼠抗肿瘤作用的肝脏代谢组学机制。[方法]将12只BALB/c小鼠于接种肿瘤细胞次日（0.2 mL/只），随机分为模型组与HFDT1组，每组6只，模型组给予生理盐水灌胃，20 mL/kg，1次/d;HFDT1组给予人工合成短肽HFDT1（7.8 mg/kg，10 mL/kg）腹腔注射，1次/d，连续10 d给予药物处理，于末次给药24 h后，收集小鼠肝脏组织。采用1 H NMR代谢组学技术分析小鼠肝脏代谢谱图差异，运用PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析方法筛选有显著性差异代谢物，探索短肽HFDT1对MFC荷瘤小鼠抗肿瘤作用的代谢通路。[结果]与模型组相比，短肽HFDT1给药组最终确定了涉及5个代谢通路变化的7种具有显著性差异的代谢物：丙酮酸水平显著下调，磷脂酰胆碱-NCH2、GPC、肝糖、酪氨酸、烟酰胺及肌苷水平显著上调。[结论]短肽HFDT1的抗肿瘤作用机制与抑制糖酵解，调节酪氨酸代谢、核苷酸代谢、烟酰胺代谢及胆碱磷酸化紊乱密切相关。
　　关键词  短肽HFDT1;MFC;1H NMR;代谢组学;抗肿瘤
　　中图分类号  R  961.1文献标识码  A
　　文章编号  0517-6611（2020）04-0088-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.026
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Preliminary Metabolomics Research on Anti-tumor Effect of Short Peptide-HFDT1 on MFC Tumor-Bearing Mice
　　WANG Xue-xue1，CHANG Xu2，OU Hong-li2 et al  （1.School of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000;2.School of Basic Medical Sciences，Dali University，Dali，Yunnan 671000）
　　Abstract  [Objective] To compare and analyze the liver metabolic mechanism of anti-tumor effect of short peptide HFDT1 on MFC tumor-bearing mice.[Method]Twelve BALB/c mice were randomly divided into model group （n=6） and HFDT1 group （n=6） after tumor vaccination.The model group was given normal saline perfusion，20 mL/kg，s.i.d; HFDT1 group was given intraperitoneum injection of synthetic short peptide-HFDT1，7.8 mg/kg，10 mL/kg，s.i.d，ten days after treatment，the liver tissues of mice were collected when 24 hours after the last administration.The differences of liver metabolic spectra in mice were analyzed by 1H NMR metabolomic.The differential metabolites were screened by PCA，PLS-DA and OPLS-DA，and the metabolic pathway of short peptide-HFDT1 on MFC tumor-bearing mice was explored.[Result]Compared with the model group，seven differential metabolites involving the changes of five metabolic pathways were finally identified in the short peptide-HFDT1 administration group，which showed that pyruvate levels were significantly down-regulated and phosphatidylcholine-NCH2，GPC，glycogen，tyrosine，nicotinamide and inosine levels were remarkably up-regulated.[Conclusion]The anti-tumor mechanism of short peptide-HFDT1 is closely related to the inhibition of glycolysis and the regulation the disorder of tyrosine metabolism，nucleotide metabolism，niacinamide metabolism，and choline phosphorylation.
　　Key words  Short peptide-HFDT1;MFC;1H NMR;Metabolomics;Anti-tumor 　　胃癌是世界上发病率最高、最致命的恶性肿瘤之一，其在我国的发病率很高;据报道，我国每10万人中就有29.9例被确诊为胃癌患者，每年有22 478人死于胃癌，约占世界胃癌死亡人数的1/2[1-2]。代谢组学在发现生物标志物、药理药效评价及作用机制研究等方面都发挥着重要作用，已被广泛应用到癌症研究中[3-6]。目前常见的代谢组学分析平台有核磁共振波谱（NMR）和质谱。其中，NMR基于良好的重现性、样品制备简单及无损检测等优点，成为目前常用而有力的代谢组学分析工具[7]。
　　短肽HFDT1是从美洲大蠊精制物CII3中分离到具有抗肿瘤活性的含12个氨基酸残基的短肽，并根据其序列人工合成。笔者所在课题组在前期研究中已证实，短肽HFDT1能够抑制肿瘤的生长、增强荷瘤小鼠特异性免疫和非特异免疫的抗肿瘤功效，且无毒副作用[8-9]，但它的具体作用机制尚有待深入研究。
　　有研究报道，肿瘤的发生发展与体内代谢的变化密切相关[3]。该研究采用1H NMR代谢组学技术，探索短肽HFDT1对MFC荷瘤小鼠的抗肿瘤作用机制，通过分析模型组与短肽HFDT1给药组小鼠肝脏代谢谱的差异，筛选鉴定与MFC荷瘤小鼠抗肿瘤作用相关的有显著性差异代谢物，以期为研究短肽HFDT1抗肿瘤作用提供新的思路。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  动物。
　　SPF级BALB/c小鼠，6周龄，体质量18～20 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：SYXK（湘）2016-0002。
　　1.1.2  肿瘤细胞株。
　　小鼠胃癌细胞（MFC），源于615小鼠胃癌组织，属于上皮肿瘤细胞系，细胞株保有血道转移的特性，购自于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（原中国科学院上海细胞生物学研究所）。
　　1.1.3  主要仪器。
　　Bruker 800 MHz核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）;组织破碎仪[迈尔莱客（广州）工业技术有限公司];低温高速离心机（西格玛实验室离心机公司）;冷冻干燥机[金西盟（北京）仪器有限公司];真空离心浓缩仪（北京照生行仪器设备有限公司）。
　　1.1.4  受试药物。短肽HFDT1从美洲大蠊精制物CII3中分离到具有抗肿瘤活性的含12个氨基酸残基的短肽，并根据其序列人工合成（专利号：2017100567877，专利申请人：大理大学，由大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室提供）[8-9]。
　　1.1.5  主要试剂及用品。
　　磷酸二氢钠（NaH2PO4，国药集团化学试剂有限公司，批号：20150417）;磷酸氢二钾（K2HPO4，国药集团化学试剂有限公司，批号：20150312）;FCS（Gibco公司）;RPMI-1640培养基（Gibco）;Cell Strainer（BD公司）。
　　1.2  方法
　　1.2.1  肿瘤细胞体外培养及荷瘤小鼠模型建立。
　　取MFC细胞株常规复苏，用10% FCS-RPMI-1640完全培养基培养至对数生长期，用PBS将细胞数调整为1×107/mL，0.2 mL/只，接种于小鼠右侧腋下。
　　1.2.2  分组及给药。
　　于接种肿瘤后次日，将小鼠随机分2组，即模型组（M组）和短肽HFDT1给药组（HFDT1组），每组6只。模型组给予生理盐水灌胃（20 mL/kg，1次/d）;HFDT1组给予人工合成短肽HFDT1（7.8 mg/kg，10 mL/kg，1次/d）腹腔注射，连续10 d给予药物处理。
　　1.2.3  肝脏样本的收集与处理。
　　于末次给药24 h后，颈椎脱臼处死所有小鼠，取肝脏组织置于-80 ℃保存。试验前室温解冻，取肝脏0.1 g，加入CH3OH/H2O溶液进行匀浆，12 000 r/min离心10 min，4  ℃，取上清液。经浓缩、冷冻干燥后得冻干粉。加K2HPO4/NaH2PO4缓冲液，涡旋混匀，12 000 r/min低温离心10 min，取上清液，置于-80 ℃保存，待1H NMR检测分析。
　　1.2.4  核磁数据处理与分析。
　　在Topspin软件中对小鼠肝脏代谢组学原始图谱进行处理，并将归一化后数据录入SIMCA-P 13.0软件中进行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），考察肝脏样本总体代谢谱图分布状况。为使组间差异最大化，利于寻找组间差异性代谢物，采用正交最小二乘法判别分析法（OPLS-DA）对数据进行分析，所有的分析结果均以得分图表示。最终根据多元分析结果，结合HMDB数据以及相关文献，初步确定短肽HFDT1对MFC荷瘤小鼠肝脏作用的差异性代谢物，并对其进行生化解释。
　　2  结果与分析
　　2.1  模型组与短肽HFDT1组小鼠肿瘤形态学观察
　　颈椎脱臼处死小鼠后，无菌收集小鼠肿瘤置于培养皿中，拍照。如图1所示，模型组肿瘤颜色鲜红且体积较大，HFDT1组与模型组相比，肿瘤体积明显缩小。这表明成功复制了课题组前期研究结果——短肽HFDT1能够抑制肿瘤的生长[8-9]。
　　2.2  短肽HFDT1对MFC荷瘤小鼠代谢组学研究
　　2.2.1  多元数据分析。
　　首先进行PCA分析，该数学模型可以从整体上观察2组间的分类趋势和离散点。如图2所示，每一个点代表1个样本，模型组（M组）与HFDT1组虽然有分离趋势，但样本离散程度较大。 　　由PLS-DA得分图（图3A）可以看出，2组间样本表现出一定的聚类现象。在PLS-DA模型成立的基础上，对原始数据建立200次排列试验（图3B），结果显示随机变量Y变量产生的R2、Q2均小于原始值，表明该模型有效可靠。为凸显组间差异，提高模型的准切性和预测能力，以便找出贡献于组间分离的主要差异性物质，使用OPLS-DA分析方法对数据进行进一步的分析。
　　由OPLS-DA得分图（图4A）可以看出，模型组与HFDT1组之间样本距离较远，组内样本聚类现象明显。模型验证结果表明，该模型具有良好的预测能力，且不存在过度拟合。此外，相应的三维得分图（图4B）显示，模型组与HFDT1组沿t[1]轴方向分离，各组内样本表现出聚类现象。基于以上的数据分析结果，提示短肽HFDT1组与模型组小鼠体内存在代谢差异。
　　2.2.2  差异代谢物的确定。
　　根据多元分析结果，比对HMDB数据库及参考相关文献，筛选出模型组与短肽HFDT1组之间具有显著性差异的代谢物。如表1所示，与模型组相比，小鼠肝脏中共筛选出7种差异性代谢物，除丙酮酸（pyruvate）外，磷脂酰胆碱-NCH2（phosphatidylcholine-NCH2）、甘油磷酸胆碱（glycerol phosphatidylcholine，GPC）、酪氨酸（tyrosine）、肝糖（glycogen）、肌苷（inosine）及烟酰胺（niacinamide）水平均在HFDT1组显著上调。这些代谢物分别涉及糖酵解、酪氨酸代谢、烟酰胺代谢、核苷酸代谢及胆碱磷酸化代谢通路。
　　3  讨论
　　胃癌是一种代谢性疾病，在癌细胞的增殖和侵袭过程中，机体代谢网络会发生紊乱，其代谢产物也会随之产生变化[10]。
　　课题组之前的试验证明，短肽HFDT1具有抗肿瘤作用[8-9]，但其作用机制尚未完全揭示。故该试验尝试通过1H NMR代谢组学技术，探究短肽HFDT1对MFC荷瘤小鼠体内代谢的影响，揭示其可能的代谢通路，探索其抗肿瘤作用。该研究发现短肽HFDT1对肿瘤细胞的生长具有比较明显的抑制作用，其抗肿瘤作用机制可能与调控涉及糖酵解、酪氨酸代谢、核苷酸代谢、烟酰胺代谢及胆碱磷酸化代谢通路关系密切。
　　3.1  糖酵解
　　许多研究证实，即使在氧充足条件下，肿瘤细胞也仍然以糖酵解为主要的供能方式，即有氧糖酵解—Warburg效应[11]。低氧条件下，肿瘤细胞大量摄取葡萄糖，由糖酵解生成的丙酮酸经乳酸脱氢酶转化为乳酸，为其自身的分化与增长提供能量。丙酮酸为糖酵解过程和TCA循环的关键中间枢纽点，在机体发生能量代謝紊乱时，丙酮酸的水平会出现异常增加。研究显示[12]，临床四期胃癌患者血清丙酮酸水平异常增高。Zhang等[13]基于1H NMR代谢组学技术发现患者胃癌组织中丙酮酸含量呈现高水平表达。该试验小鼠肝脏中丙酮酸含量在给予短肽HFDT1治疗后显著下调，同时肝糖水平显著升高，提示短肽HFDT1可以抑制糖酵解速率，减少肿瘤细胞的能量供给，减缓肿瘤细胞的增长速度。
　　3.2  烟酰胺代谢
　　有研究表明，烟酰胺在肿瘤患者血浆中低表达，烟酰胺可以通过促进RUNX3基因的表达，从而抑制人膀胱肿瘤移植瘤及致癌原诱导的鼠膀胱肿瘤的生长速度[14-15]。该试验中，HFDT1组烟酰胺水平显著升高，提示HFDT1可能通过提高烟酰胺水平，促使RUNX3基因的表达，抑制小鼠胃癌细胞的生长与增殖。
　　3.3  核苷酸代谢
　　肿瘤细胞处于快速增殖和分化状态，核苷酸合成和代谢频率明显升高;在胃癌患者或动物模型中，以核苷酸分解代谢产物尿酸或尿酸盐的积累为主要特征[10]。有文献报道[16]，肌苷在体内参与细胞的能量代谢和蛋白质的合成，提高相关代谢酶的活性，发挥保护细胞作用，并作为在细胞缺氧条件下产生ATP的替代能量来源。此外，肌苷还具有抗氧化应激的作用[17]。Nie等[18]基于UHPLC-Q-TOF/MS代谢组学技术发现与胃癌裸鼠模型组相比，改良后四君子汤治疗组裸鼠血浆中肌苷水平显著增加。该试验中，在给予短肽HFDT1治疗后，小鼠肝脏中的肌苷水平显著上升，与上述文献报道结果一致。试验结果提示短肽HFDT1可能通过抑制肌苷分解速率，增加肌苷含量，恢复低能缺氧状态下细胞的正常代谢，减轻机体的氧化应激损伤。
　　3.4  酪氨酸代谢
　　在肿瘤代谢组学的研究中，多种氨基酸被认为是有助于研究多种恶性肿瘤的潜在生物标志物[19]。根据文献报道，肿瘤细胞为满足自身急剧增长的蛋白质合成需求，需要在癌症病灶周围累积足够的芳香族氨基酸，如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等[20]。该试验中，HFDT1组酪氨酸水平明显上调，这一结果可能与短肽HFDT1抑制肿瘤细胞的增长与分化，导致体内酪氨酸的大量堆积有关。
　　也有研究发现，胃癌患者血浆中酪氨酸含量异常减少[21]，这可能是机体代偿反应的作用结果，同时也说明酪氨酸代谢在肿瘤中的作用有待进一步深入研究。
　　3.5  胆碱磷酸化
　　肿瘤中胆碱磷酸化的紊乱通常伴随着含胆碱代谢物的改变，其中，在多种癌症患者中磷酸胆碱（PC）和GPC水平增加得到了广泛报道[22]。胆碱、PC和GPC在胆碱磷酸化过程中可相互转化，对细胞膜的生物合成与降解有非常重要的意义。该研究中，与模型组相比，HFDTI组小鼠肝脏中磷脂酰胆碱-NCH2和GPC含量呈现上升趋势，提示生物膜的合成需求升高，这一需求可能是为了满足肝脏的自身修复。结果表明短肽HFDT1可能通过调节胆碱磷酸化，起到修复受损细胞膜的作用。
　　4  结论
　　该研究基于NMR代谢组学方法，分析了MFC荷瘤小鼠模型组与短肽HFDT1给药组肝脏的代谢组特征以及组间的代谢组差异，发现MFC荷瘤小鼠给药后，肝脏中涉及糖酵解、酪氨酸代谢、核苷酸代谢、烟酰胺代谢及胆碱磷酸化代谢通路的多种代谢物水平异常变化，这些代谢通路的变化可能是短肽HFDT1的作用结果，初步揭示了其抗肿瘤作用与调节机体代谢紊乱密切相关。此外，该研究也提示代谢组学技术可以从整体上评价分析药物的作用机制，有可能为抗癌药物的筛选与研发提供了新思路。 　　该试验初步揭示了短肽HFDT1对MFC荷瘤小鼠抗肿瘤作用，在后续研究中，可考虑采用动态观察代谢物变化（多个时间点采样）及结合其他技术，如与LC/MS、蛋白质组学联用等，从多方面、多角度更加深入探究短肽HFDT1抗肿瘤的作用机制。
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