咖啡湿法发酵中使用果胶酶对脱胶时间与杯品质量的影响

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　　摘  要：以云南阿拉比卡咖啡为原料，在咖啡湿法发酵环节中加入Pectinex Ultra SP-L果胶酶进行脱胶，并对加工出的咖啡豆进行理化及感官分析。结果表明：与自然发酵脱胶相比，果胶酶脱胶能缩短脱胶时间，有效快速脱除咖啡果胶。其脱胶时间与果胶酶的浓度、脱胶温度、鲜果成熟度呈正相关。与自然发酵脱胶相比，果胶酶脱胶所得咖啡豆的内含物质无显著差异，杯品质量干净稳定。就咖啡豆的杯品质量而言，0.01%果胶酶添加量脱胶处理要高于自然发酵脱胶，而添加量为1.00%、0.10%果胶酶脱胶处理略低于自然发酵脱胶。综上所述，果胶酶脱胶能保证咖啡品质的稳定性及提高咖啡加工效率，具有应用前景。
　　关键词：咖啡;湿法发酵;果胶酶;脱胶时间;杯品质量
　　中图分类号：TS273     文献标识码：A
　　Abstract： Yunnan arabica coffee was used as the raw material. Pectinex Ultra SP-L pectinase was added in the wet fermentation process of coffee to remover pectin， and the physicochemical and sensory properties of the processed coffee beans were analyzed. The results show that pectinase could effectively and rapidly remove coffee pectin compared with the natural fermentation， and the pectin removing time was positively correlated with the concentration of pectinase， pectin removing temperature and maturity of fresh fruits. There was no significant difference in the contents of coffee beans obtained with pectinase and natural fermentation， and the cup quality was clean and stable. The cup quality of coffee beans treated by pectinase with low concentration of 0.01% was higher than that by natural fermentation， while that of the 1.00% and 0.10% pectinase treated was slightly lower than that of the natural fermentation.
　　Keywords： coffee; wet fermentation; pectinase; pectin removing time; cup quality
　　咖啡鮮果外果皮和内果皮之间有一层果胶状物，组成成分复杂，主要由水分、多种糖类、果胶等组成，其物质在咖啡湿法发酵过程中会被降解脱除[1]。发酵降解果胶方式与香气特征呈现存在复杂关系[2-3]，可通过不同的发酵方法来调整咖啡香气[4-5]。脱胶是湿法加工过程中的关键环节，在咖啡脱皮后，以水为介质，把脱皮后的咖啡浸泡到水中，依靠果胶本身所含的酶进行生物发酵脱胶，复杂且质量难把控[6]，发酵过程控制不当会给咖啡的香气及风味带来负面影响，发酵不足及过度发酵是生产中比较突出的问题。
　　目前咖啡脱胶主要有自然发酵、机械、化学和物理脱胶[7]。自然发酵脱胶时间长且易受环境温度影响，而机械脱胶破损率高，化学脱胶污染大，物理脱胶不干净，以上脱胶技术均在不同程度上制约着咖啡品质和经济效益的提高。生产上需要一种优质稳定而高效的脱胶方法。生物脱胶是一种绿色环保的方法，主要包括微生物脱胶和酶脱胶，在食品加工、亚麻加工等方面应用较多[8-10]。国外将生物脱胶应用于咖啡发酵脱胶的研究相对国内比较成熟[11]。Silva等[12]、de Melo等[13]、Avallone等[14]筛选具有果胶溶解活性的细菌和酵母种类，确定其是否适合作为生物发酵剂在咖啡中使用。Evangelista等[15-16]采用精选的酵母菌进行生物发酵，提高咖啡饮品质量。以上均是关于微生物在咖啡脱胶方面的研究，但采用生物酶在咖啡脱胶方面的研究比较少。本研究拟开展果胶酶脱胶对脱胶速度及咖啡品质影响的研究，在咖啡湿法发酵过程中加入不同浓度的Pectinex Ultra SP-L果胶酶进行发酵脱胶，测定感官及理化指标，筛选出最佳的经济浓度，获得基础数据，为云南阿拉比卡咖啡湿法加工妥善解决发酵品质稳定性提供一定的理论依据。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  材料与试剂  咖啡鲜果采摘于云南农业大学热带作物学院咖啡种植园，海拔1000～1200 m，品种为目前云南主栽的阿拉比卡咖啡。
　　果胶酶为诺维信公司生产的Pectinex Ultra SP-L 咖啡果胶酶。
　　1.1.2  仪器与设备  6KTP-480型咖啡脱皮机，UV-1800PCDS2型分光光度计，上海荣欣DHG-9145A型干燥箱，梅特勒-托利多ME204E型电子分析天平。
　　1.2  方法
　　1.2.1  果胶酶浓度与脱胶时间  取40 kg全成熟的咖啡鲜果，进行浮选分级，剔除漂浮果及异物，用咖啡脱皮机进行脱皮，将带果胶的咖啡平均分成4份，每份6 kg，分别放进装有4 L清水、无盖的不锈钢桶里，再分别加入豆和清水总重量的0.01%、0.10%、1.00%浓度 Pectinex Ultra SP-L果胶酶，以不加果胶酶为对照。每隔 20 min观察1次脱胶程度，脱胶程度的判断方法采用物理方法，用手抓取咖啡豆并搓揉，当豆体不黏滑有粗糙感时界定为完成脱胶。脱胶过程中的最低温度为17 ℃，最高温度为30 ℃。 　　1.2.2  温度对果胶酶脱胶时间的影响  取30 kg全成熟的咖啡鲜果，进行浮选分级，剔除漂浮果及异物，用咖啡脱皮机进行脱皮，将带果胶的咖啡豆平均分成3份，每份6 kg，分别放进装有4 L清水、无盖的不锈钢桶里，选用 Pectinex Ultra SP-L 果胶酶的浓度为0.01%，分3次实验，分别是2017年11月、2017年12月、2018年1月分别于晚上和白天自然日照下研究温度对果胶酶脱胶时间的影响。晚上定义为19：00—6：59;白天定义为7：00—18：59，所计温度为室外咖啡豆体温度，为能与生产实际结合，采用自然温度，不采用人工控温。
　　1.2.3  鲜果成熟度对果胶酶脱胶时间的影响  在初步确定最佳经济浓度为0.01%后，分别采用过熟果、全红果、青果、及3者未分选混果4个不同等级的样品研究鲜果成熟度对果胶酶脱胶时间的影响。
　　1.2.4  咖啡豆理化指标检测方法  水分采用LY-TK2咖啡豆水分测试仪检测;灰分按 GB/T 5009.4-2010标准检测;咖啡因按GB/T 5009.139- 2003 标准检测;总糖按GB/T 5009.7-2008标准检测;粗蛋白按 GB/T 5009.5-2010 标准检测;粗脂肪按GB/T 5009.6-2003标准检测;镁含量按GB 5009.241-2017标准检测;钙含量按GB 5009.92- 2016 标准检测;铁含量按GB 5009.90-2016标准检测。
　　1.2.5  咖啡熟豆杯品质量评价  （1）咖啡杯品质量检测。本研究参照美国精品咖啡协会（SCAA）咖啡杯测评定方法进行。评定指标包括：干香/湿香（fragrance/aroma）、风味（flavor）、回味（aftertaste）、酸度（acidity）、醇厚度（body）、平衡感（balance）、一致性（uniformity）、干净度（clean cup）、甜味（sweetness）、整体评价（overall）等10个方面。从6分开始标注打分，一共分为4个级别，6分为“好”（good）;7分为“非常好”（very good）;8分为“优秀”（excellent）;9分为“超凡”（outstanding）。每个等级又分4个给分等级，给分单位是0.25分，因此，4个等级共16个给分点。邀请经过专业训练的6名咖啡品鉴师（Q grader）进行评价。
　　（2） 咖啡烘焙方法。杯品熟豆采用SCAA生豆标准化烘焙进行烘焙，样品烘焙全豆的Agtron值为58（+/1），研磨咖啡粉的Agtron值为63（+/1），样品烘焙12小时后进行杯测。所有样品都采用相同的烘焙曲线，烘焙曲线记录见表1。
　　1.3  数据处理
　　采用 Excel 2010 软件处理数据，利用SPSS 16.0 软件计算平均值及进行差异显著性分析。
　　2  结果与分析
　　2.1  果胶酶制剂的最佳经济浓度选择
　　使用不同浓度的果胶酶后咖啡果脱胶时间见表2。由表2可见，自然发酵脱胶果胶全部脱除需要46 h，近2 d的时间。添加果胶酶酶解以后，脱胶时间随着所添加果胶酶的浓度增加而缩短，其说明脱胶效率与添加果胶酶浓度呈正相关。为保证咖啡的品质，咖啡鲜果采摘以后都需放置在阴凉通风的地方，并于采摘当天进行加工处理，在生产上一般都是早上8：00左右采摘，晚上19：00加工。若采用传统的自然发酵脱胶，因发酵时间太长，往往需要将鲜果囤放几天来解决发酵池的使用问题，也易导致发酵过度而影响品质。采用果胶酶脱胶可缩短发酵脱胶时间，从而加速脱胶速度，解决自然脱胶耗时、品质不稳定的问题。
　　2.2  温度对果胶酶脱胶时间的影响
　　筛选出最佳的经济浓度0.01%后，为能在生产中更好的推广使用，选用日间和夜间发酵脱胶温度来对比发酵温度对脱胶时间的影响。由表3可知，加入相同浓度的果胶酶脱胶后，日间脱胶时间比夜间脱胶时间短。3个月份的日间温度在21～27 ℃之间，夜间温度在11～13 ℃之间。因此，在11～27 ℃温度范围内，咖啡的脱胶时间与温度呈正相关。温度对于果胶酶的活性影响较大，温度过高容易使酶变性，温度过低，酶促反应速率较低。果胶酶多以单体形式存在，最适温度为45～50 ℃，60 ℃保温条件时，酶活性下降速度快[17]。咖啡产区主要分布在热带、亚热带南北纬25靠近赤道以内的区域。在产区生产加工过程中，脱胶发酵池均建在室外，基本無法做到人工调控发酵脱胶温度。本研究是基于咖啡生产过程中的室外发酵脱胶环境，及普洱当地的气温范围来研究温度对果胶酶脱胶时间的影响。
　　2.3  鲜果成熟度对果胶脱胶时间的影响
　　将采摘回来以后的鲜果按照成熟度分为过熟果、全红果、青果及3者未分选的混果4个等级，加入等量0.01%的果胶酶。由表4可知，在过熟果、全红果和青果3个等级中，成熟度越高，添加果胶酶后的脱胶时间越短。这与咖啡鲜果在成熟过程中自身所带微生物产生果胶酶有关。在果实成熟之前，果胶主要是以不溶于水的原胶形式存在，随着果实的成熟，果实中的一些酶类能够通过断裂果胶的主链或是侧链来改变果胶的结构，原果胶结构改变后，它们将细胞间的果胶质溶解，从而使果实变得松软[18]，形成能够溶于水的果胶类物质。Muhammad[19]研究表明，咖啡果皮含有果胶酯酶和多甲酯酶，绿色果实上的酶活性高于黄色果实。果实变浅红色时，活性第2次增加，果实的最佳发酵条件取决于果实的成熟程度，当果实颜色变暗红色时果胶酶的活性最佳。董红红[20]研究发现，咖啡湿法发酵过程中的微生物里有产生果胶酶的菌种。因此，成熟度越高的咖啡果实，加入相同浓度的果胶酶后脱胶时间越短。 　　2.4  生咖啡豆水分的测定
　　在咖啡湿法发酵脱胶环节添加不同浓度的果胶酶脱胶后，通过采用相同的自然干燥条件，将所得咖啡生豆的含水率控制在一定范围内，提高烘焙阶段咖啡豆的风味口感[21]，同时可避免在咖啡杯品时因水分含量差异所带来的感官风味误差。通过检测（表5），4个处理咖啡生豆的含水率在11.2%～11.5%之间，符合咖啡生豆储存含水率在11.5%～12.5%之间的标准[22]，且它们之间的
　　2.5  咖啡熟豆主要理化成分分析
　　由表6可以看出，脱胶环节加入0.01%、0.10%、1.00%的果胶后，咖啡熟豆里的灰分、脂肪、蛋白质、总糖、咖啡因、绿原酸等内含物质与传统自然发酵相比，差异不显著。说明在咖啡初加工过程中添加果胶酶不会影响或改变咖啡豆的主要化学成分，能保证品质的稳定性。
　　2.6  添加果胶酶脱胶后咖啡熟豆的杯品质量分析
　　咖啡杯品是检验咖啡质量、口味的一种方法，杯品结果是咖啡品质的重要指标，在咖啡贸易中，咖啡杯测是一个必经的检测环节。咖啡豆经过统一标准烘焙，采用美国精品咖啡协会（SCAA）杯测表对样品感官质量评估打分，每个样品测5杯。
　　由表7可以看出，添加1.00%浓度的果胶酶脱胶所得咖啡豆的杯品质量最差，添加0.01%果胶酶脱胶所得咖啡豆的杯品质量最好。自然发酵脱胶所得咖啡豆的杯品质量略高于果胶酶浓度为0.10%的处理，这可能是与脱胶过程中的发酵时间长短产生特征香气有关。添加高浓度的果胶酶后，缩短了脱胶时间，减少了发酵时间，有些风味物质还没被激活，导致风味品质不是最好。而自然发酵脱胶时间太长，导致有些成分流失，Velmo?u?rougane[5]研究表明，在阿拉比卡咖啡中经过20 h发酵获得良好的杯品特性，随着更长时间的发酵风味成分略有减少，主要原因是发酵液中真菌数量增加。本研究加入高浓度果胶酶虽然可大大缩短脱胶时间，提高加工效率，但杯品质量并不是最好的，所以要筛选出能提高加工效率又能最大程度激发出咖啡风味物质的果胶酶添加浓度，即为0.01%。
　　从SCAA评价标准来看，4个处理分数集中在80分上下，得分最高的是果胶酶浓度为0.01%的一组，81.33。得分最低的是果胶酶添加浓度1.00%的处理组，为79.54两者差距1.88分，但均在精品咖啡范围内。因此，在咖啡湿法加工中使用果胶酶，咖啡杯品质量是比较稳定的。
　　2.7  添加果胶酶脱胶后经济效益评估
　　由表8可知，传统自然发酵脱胶时间为46 h，期间需要更换2次发酵脱胶用水，且需要人工搅拌数次，添加0.01%果胶酶后，发酵时间仅需13 h，缩短了33 h，每吨鲜果可直接节约180元的成本。同时，解决了采收旺季因自然发酵脱胶时间长发酵池及人工紧张问题。此外，加工用水节约的同时减少了脱胶废水的排放量，降低环境污染。综合评估，使用果胶酶脱胶可以节约生产成本。
　　3  讨论
　　咖啡是云南的特色产业之一，咖啡脱胶技术是初加工过程中影响品质的重要环节之一，云南咖啡80%以上都采取湿法加工的方式来生产水洗咖啡。广大的咖啡种植农户和小企业采用发酵脱胶的传统湿法加工方式[23]，其方式存在发酵时间长、耗水量大、占用发酵池、发酵程度把握不准容易出现过度发酵问题。本研究以云南阿拉比卡咖啡为原料，在咖啡湿法加工发酵脱胶过程中使用Pectinex Ultra SP-L型果胶酶进行脱胶。研究发现，Pectinex Ultra SP-L型果胶酶能缩短咖啡果胶脱胶时间，从而加快脱胶速度，脱胶时间与所添加果胶酶的浓度成正比，这与程金焕等[24]的研究结论一致。本研究进一步发现，脱胶时间还与脱胶温度、鲜果成熟度呈正比。常规理化分析表明，果胶酶脱胶不会影响咖啡豆内含物质灰分、总糖、脂肪、蛋白质、咖啡因、绿原酸的含量。添加0.01%浓度的Pectinex Ultra SP-L果胶酶后咖啡熟豆的杯品质量最好，这与恰当的发酵脱胶时长有关系，发酵不足或发酵过度都会影响咖啡的品质。使用1.00%、0.10%、0.01%的果胶酶脱胶后，所得咖啡豆杯品质量与传统发酵脱胶所得咖啡豆的杯品质量总体趋于一致，其说明果胶酶的合理使用不会对咖啡豆的品质带来负面影响，能保证品质的一致性。同时，缩短脱胶时间以后，脱胶用水及人工减少，脱胶发酵池利用频率提高，节约成本，还可减少脱胶废水排放，有利于保护环境污染。
　　本研究仅仅从普洱咖啡产区气候情况为实验条件进行研究，因酶的专一性及活性受限比较大，若需要在其它咖啡产区推广使用，最佳浓度还需根据当地气候条件进行筛选。咖啡的风味除了与内含物质脂肪、蛋白质、总糖、咖啡因、绿原酸及矿物质有关外，还与香气成分密切关联，本研究未对使用果胶酶后的咖啡香气成分及形成机理做研究，这也是下一步研究的方向及重点。
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