Bmal1低表达对胰岛β细胞功能的影响

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　　摘要：目的  研究生物钟基因芳香烃受体核转位蛋白样1基因（Bmal1）低表达对大鼠胰岛细胞瘤细胞-1（INS-1）功能的影响。方法  应用大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞，随机将INS-1细胞分为空白组、阴性对照组和Bmal1 siRNA组，通过RNA干扰技术沉默Bmal1，比较三组细胞内活性氧（ROS）水平、胰岛素（GSIS）含量、核因子E2相关因子2（Nrf2）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）mRNA表达，并采用透射电镜观察线粒体结构变化。结果  阴性对照组与空白组ROS水平、GSIS含量、Nrf2、CAT、GSH-Px mRNA表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）;Bmal1 siRNA组ROS水平、Nrf2表达高于阴性对照组，GSIS含量、CAT、GSH-Px mRNA表达低于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。透射电镜结果显示，在空白组和阴性对照组中线粒体为圆形或椭圆形，具有完整的膜和少量管状嵴;Bmal1 siRNA组中线粒体肿胀、形状不规则，线粒体嵴断裂和消失。结论  Bmal1低表达可导致β细胞氧化应激增强，GSIS下降，其作用机制可能与影响Nrf2信号通路有关。
　　关键词：芳香烃受体核转位蛋白样1基因;β细胞;核因子E2相关因子2;氧化应激
　　中图分类号：R733.7                                文獻标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.03.020
　　文章编号：1006-1959（2020）03-0066-03
　　Effect of Bmal1 Supression on Pancreatic β-Cell Function
　　YE Lyu，WU Hua-xiang，XU Wei-hong
　　（Department of Rheumatology， School of Medicine， The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University，
　　Hangzhou 310009， China）
　　Abstract：Objective  To investigate the effect of brain and muscle arnt-like 1 （Bmal1） on the function of insulinoma cell line （INS-1 cells）.Methods  INS-1 cells were randomly divided into blank control group， negative control group and Bmal1 siRNA group. Bmal1 was silenced by RNA interference technology， and the intracellular reactive oxygen species （ROS） levels， glucose-stimulated insulin secretion （GSIS）， nuclear factor erythroid-2 related factor 2 （Nrf2）， catalase （CAT） and glutathione peroxidase （GSH-Px） mRNA expressions were compared in the three groups. Mitochondrial morphological changes were observed by transmission electron microscopy.Results  There was no significant difference in the ROS level， GSIS， Nrf2， CAT， GSH-Px mRNA expression between the negative control group and the blank group （P>0.05）. The Bmal1 siRNA group had higher ROS levels and Nrf2 expression than the negative control group， and the GSIS， CAT， and GSH-Px mRNA expression were lower than the negative control group. The differences were statistically significant （P<0.05）. Transmission electron microscopy results showed that the mitochondria were round or oval in the blank group and the negative control group， with a complete membrane and a few cristae. In the Bmal1 siRNA group， the mitochondria were swollen with irregular shape， and the mitochondrial cristae were fragmented and disappeared. Conclusion  Bmal1 inhibition can lead to increased oxidative stress in β-cell and decreased GSIS via Nrf2 signaling pathway. 　　Key words：Brain and muscle arnt-like 1;Pancreatic β-cell;Nuclear factor erythroid-2 related factor;Oxidative stress
　　生物钟调控哺乳动物的生理、能量代谢和行为活动的昼夜节律。时钟系统由位于下丘脑视交叉上核的中枢生物钟以及外周组织的外周生物钟组成[1]，其运行受正向调控成员芳香烃受体核转位蛋白样1基因（Bmal1）和时钟基因与反向调控成员（周期基因1、周期基因2、隐色素基因1和隐色素基因2）构成反馈回路控制[2]。Bmal1是生物钟基因最重要成员之一，而生物钟基因异常与糖尿病的发病密切相关[3，4]，动物实验已证实[5]，敲除小鼠β细胞Bmal1基因后，小鼠代谢功能紊乱，导致高血糖和低胰岛素血症。然而，目前对Bmal1调控胰岛β细胞功能的分子机制了解较少。此外，β细胞功能障碍在糖尿病发病中起关键作用，其中氧化应激是导致β细胞功能障碍的主要原因之一[6]。氧化应激时，活性氧（ROS）生成过多，抗氧化系统[核因子E2相关因子2（Nrf2）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）][7]和氧化系统失衡，导致组织细胞损伤。而研究Bmal1是否参与调节β细胞的氧化应激反应，有助于进一步了解糖尿病的发病机制。本研究应用大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞，通过RNA干扰技术沉默Bmal1，探讨Bmal1对β细胞功能的作用，现报道如下。
　　1材料和方法
　　1.1实验细胞  大鼠胰岛细胞瘤细胞-1（INS-1）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
　　1.2试剂  胎牛血清、巯基乙醇、左旋谷氨酰胺、HEPES、青霉素-链霉素溶液和RPMI-1640培养液（美国Gibco公司），LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）、RNA提取试剂盒（美国Ambion公司），PCR试剂盒（美国Vazyme公司）。
　　1.3细胞培养  INS-1细胞的培养条件为含10%胎牛血清、50 μmol/L巯基乙醇、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、10 mmol/L HEPES和11.2 mmol/L葡萄糖的RPMI-1640培养液，置于含5% CO2的37℃培养箱中进行培养。细胞随机分为空白组、阴性对照组和Bmal1 siRNA组。
　　1.4细胞转染  将处于对数生长期的INS-1细胞按照每孔2×105个细胞数接种于细胞培养6孔板培养过夜。转染前换成无血清1640培养基，显微镜下观察细胞，当细胞密度达到70%时使用LipofectamineTM 2000试剂进行转染，转染步骤参考试剂说明书进行。转染24 h后，加入5.5 mmol/L的葡萄糖，继续培养24 h后收集细胞。
　　1.5流式细胞术检测细胞内ROS水平  按照ROS检测试剂盒说明书检测细胞内ROS水平：加入1 ml DCFH-DA，37℃避光孵育20 min，每隔3 min混匀一下。使用无血清细胞培养液洗涤细胞3次。收集细胞用流式细胞仪进行检测荧光强度差异，激发波长为488 nm，发射波长为530 nm。
　　1.6胰岛素分泌测定  细胞经转染等处理后，将细胞培养液换为含2.8 mmol/L葡萄糖的KHB缓冲液37℃孵育1 h;用KHB缓冲液洗细胞3次，然后分别用含2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖的KHB缓冲液37℃孵育细胞1 h，收集上清，检测胰岛素含量。
　　1.7实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测Nrf2、CAT、GSH-Px mRNA的表达  用Trizol法提取各组细胞的总RNA。按试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。反转录条件：25℃ 5 min，50℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 10 min。PCR扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，循环40次。根据2-ΔΔCt法，以GAPDH为内参，计算Nrf2、CAT、GSH-Px基因相对表达水平。实验所有引物序列均由杭州擎科生物公司合成。
　　1.8透射电镜观察线粒体结构  样品用2.5%戊二醛固定2 h，然后用锇酸固定2 h。随后将样品在乙醇和丙酮中脱水并包埋在SPI-Pon-812中。使用切片机将切片切成0.1 mm厚度，随后用柠檬酸铅和醋酸铀染色，最后通过HT7700-SS电子显微镜进行观察。
　　1.9统计学方法  采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以（x±s）表示，多组间比较使用单因素方差检验，组间两两比较使用t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1三组ROS水平比较  阴性对照组与空白组ROS水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;Bmal1 siRNA组ROS水平高于阴性对照组（P<0.05），见图1。
　　2.2三组GSIS含量比较  阴性对照组与空白组GSIS含量比较，差异无统计学意义（P>0.05）;Bmal1 siRNA組GSIS含量低于阴性对照组（P<0.05），见图2。
　　2.3三组Nrf2、CAT、GSH-Px mRNA表达比较  阴性对照组与空白组Nrf2、CAT、GSH-Px mRNA表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Bmal1 siRNA组Nrf2表达高于阴性对照组，CAT、GSH-Px mRNA表达低于阴性对照组（P<0.05），见图3。
　　2.4三组胰岛β细胞线粒体结构比较  在空白组和阴性对照组中，线粒体为圆形或椭圆形，具有完整的膜和少量管状嵴;Bmal1 siRNA组中线粒体肿胀，形状不规则，线粒体嵴断裂和消失，见图4。 　　3讨论
　　人体多种生理、代谢过程由生物钟调控，具有昼夜节律性[8]。生物钟基因在糖尿病发病中具有重要作用。胰岛β细胞功能衰竭是糖尿病发病的关键环节，氧化应激是引起β细胞功能受损的主要机制之一。但目前关于Bmal1对胰岛β细胞作用的研究较少，其生物钟基因Bmal1是否通过抗氧化系统调控β细胞功能尚不明确。
　　研究发现[9]，糖尿病患者体内氧化应激增强，β细胞内抗氧化酶含量减少，抗氧化能力低于其他组织，从而对氧化应激损伤较为敏感。当糖尿病患者ROS水平升高时，可能会引起胰岛β细胞GSIS功能受损[10]。本研究结果发现，阴性对照组与空白组ROS水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;Bmal1 siRNA组ROS水平高于阴性对照组、GSIS低于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05），说明抑制Bmal1表达后，INS-1细胞中ROS水平增加，GSIS下降。线粒体是细胞能量代谢中心，ROS产生的主要部位，线粒体损伤引起的ATP合成减少以及氧化应激产物积聚可进一步导致细胞损伤和凋亡。本研究中Bmal1 siRNA组透射电镜结果显示，抑制Bmal1表达后，β细胞表现出线粒体肿胀，线粒体嵴断裂和消失，提示氧化应激是Bmal1基因异常导致β细胞功能损伤的重要机制之一。
　　Nrf2是内源性抗氧化应激的关键转录因子，通过调节多种抗氧化基因功能（CAT、GSH-Px、血红素氧化酶-1、超氧化物歧化酶等）在抗氧化、抗凋亡等方面起着重要作用。Nrf2信号通路活化可减轻氧化应激对细胞的损伤作用。激活Nrf2可减轻高糖诱导的内皮细胞损伤[11]，反之，抑制Nrf2加重高糖诱导的心肌细胞损伤[7]。本研究发现，阴性对照组与空白组Nrf2、CAT、GSH-Px mRNA表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Bmal1 siRNA组Nrf2表达高于阴性对照组，CAT、GSH-Px mRNA表达低于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05），说明抑制Bmal1基因后，Nrf2 mRNA表达增加，但CAT、GSH-Px mRNA表达下降，提示抑制Bmal1基因导致高水平的氧化应激状态，超出细胞对氧化物的抗氧化能力，使得抗氧化系统紊乱，导致细胞氧化应激损伤。
　　综上所述，Bmal1低表达可导致β细胞氧化应激增强，GSIS下降，其作用機制可能与影响Nrf2信号通路有关。
　　参考文献：
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　　[9]Miki A，Ricordi C，Sakuma Y，et al.Divergent antioxidant capacity of human islet cell subsets：A potential cause of beta-cell vulnerability in diabetes and islet transplantation[J].PLoS One，2018（13）：e0196570.
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　　收稿日期：2019-12-11;修回日期：2019-12-21
　　编辑/杜帆
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