乳酸菌发酵对铁皮石斛活性物质含量及其抗氧化能力的影响

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　　摘  要：以铁皮石斛为原料，利用乳酸菌发酵生产风味饮料，对铁皮石斛汁发酵前后多糖、石斛碱、总酚、总黄酮含量及抗氧化能力变化情况进行研究。结果表明，植物乳杆菌对石斛多糖的消耗最高，比原汁减少了41.63%。植物乳杆菌与保加利亚乳杆菌按1∶1混合发酵对石斛碱的消耗最高，比原汁减少了4.92%。经乳酸菌发酵，总酚、总黄酮含量均比发酵前有提高，其中以植物乳杆菌与保加利亚乳杆菌按比例1∶1混合发酵提高幅度最大，总酚与总黄酮含量分别提高了24.17%和31.87%。铁皮石斛汁发酵后对羟基自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力均比发酵前有所增强。本研究说明，利用乳酸菌发酵可提高铁皮石斛活性物质的溶出率，从而提高铁皮石斛乳酸菌饮品抗氧化功能。
　　关键词：铁皮石斛;乳酸菌;发酵;活性物质;抗氧化
　　中图分类号：S567      文献标识码：A
　　Effects of Lactobacillus Fermentation on Active Substance and Antioxidant Activity of Dendrobium candidum
　　HUANG Zhenyong1， ZHANG Ezhen2*， DAN Ming2， LIANG Xiaojun2， WEI Baoyao1， WEI Xinping2
　　1. College of Light Industry and Food Engineering， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530005， China; 2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China
　　Abstract： Dendrobium candidum was used to produce beverage fermented by Lactobacillus. The changes of polysaccharide， dendrobium， total polyphenols， total flavonoids and antioxidant capacity were discussed before and after fermentation. The consumption of dendrobium polysaccharide was the highest after fermented with Lactobacillus plantarum，
　　41.63% lower than the original juice. The consumption of dendrobium was the highest when fermented with Lactoba-
　　cillus plantarum and Lactobacillus bulgaricus in 1∶1， 4.92% lower than the original juice. The content of total phenol
　　and total flavonoids increased after fermentation. The content of total phenol and total flavonoids increased by 24.17%
　　and 31.87% after fermented with Lactobacillus plantarum and Lactobacillus bulgaricus in 1∶1. The scavenging ability
　　of hydroxyl radicals， DPPH radicals and superoxide anions after fermentation increased also. The experiment showed that the active substance dissolution rate of D. candidum could be improved through Lactobacillus fermentation， and the antioxidant function of the fermented beverage from D. candidum be improved as well.
　　Keywords： Dendrobium candidum; Lactobacillus; fermentation; active substances; antioxidant
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.021
　　鐵皮石斛（Dendrobium candidum）为兰科草本植物，是石斛中药用价值最高的品种[1]，适宜在温暖、湿润、半阴半阳的环境中生长。因其表皮呈铁绿色而得名[2]，主要分布于云南、广西、广东、贵州、江西等地，民间素有“救命仙草”、“药中黄金”之美称[3]，列“中华九大仙草”之首[4]。铁皮石斛富含石斛多糖、生物碱、酚类、类黄酮、氨基酸和多种微量元素，具有增强免疫力[5]、抗肿瘤[6]、降低血糖[7]、抗氧化[8-10]、延缓衰老[11]等功能，其显著的生理活性为发展功能食品提供良好的原料来源。随着生活水平的日益提高，在高强度、高节奏的生活状态下，越来越多的人出现亚健康状态，新型高效保健食品有待研发，保健功能极佳的铁皮石斛拥有广阔的发展前景[12]。 　　乳酸菌是一类具有保健型功能的益生菌，可产生大量乳酸，提高食品营养价值[13]。陈永芳等[14]研究表明，乳酸菌可提高胡萝卜汁的抗氧化能力。张慧芸等[15]在用微生物发酵谷物的研究中，也证实微生物确实能提高总酚含量及抗氧化性。目前，铁皮石斛的使用多以鲜条榨汁、枫斗煲汤、干品粉碎冲调等形式为主。本研究利用乳酸菌对铁皮石斛汁进行发酵，探讨其发酵前后石斛多糖、石斛碱、总酚、总黄酮含量以及抗氧化能力的变化情况，为丰富铁皮石斛市场产品种类，提升铁皮石斛产品的附加值，同时为铁皮石斛深加工产品研发提供参考。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  材料与试剂  铁皮石斛鲜条，购于广西南宁市。
　　发酵菌种：植物乳杆菌菌剂（Lactobacillus plantarum，以下简写LP）、保加利亚乳杆菌（Lacto ba cillus bulgaricus，以下简写LB），购于河北一然生物科技有限公司。
　　没食子酸（纯度≥98%）、石斛碱标准品（纯度≥98%）、DPPH（纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司;福林酚试剂应用液（1 mol/L），北京索莱宝科技有限公司;邻二氮菲、过氧化氢（30%）、葡萄糖、邻苯三酚、无水乙醇、无水碳酸钠、磷酸、苯酚、浓硫酸、硝酸铝、亚硝酸钠，均为国产分析纯。
　　1.1.2  仪器与设备  SW-CJ-1FD单人单面洁净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）、LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、TW323L精密电子天平（日本岛津）、JM-L50型胶体磨（郑州玉祥机械设备有限公司）、TG-200B台式空气恒温培养摇床（上海天星实验仪器制造有限公司）和Genesys10S UV-VIS紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific）。
　　1.2  方法
　　1.2.1  工艺流程  铁皮石斛→除杂清洗→切段打漿→胶体磨研磨→过滤→分装→灭菌→冷却、接种→发酵→冷藏→指标测定。
　　1.2.2  石斛汁的制备  选取新鲜铁皮石斛鲜条，用清水洗净表面泥沙、污垢，去离子水烧开后将洗净的石斛鲜条放入开水中，开水煮沸1～2 min，捞出沥干。将冷却后的石斛鲜条用沸水消煮过的刀具切成小段，按质量比1∶80比例加入饮用纯净水进行打浆。将石斛浆液置于胶体磨中，先粗磨后进行细磨。将细磨后的石斛汁用200目的滤布进行过滤，滤渣经胶体磨反复研磨，过滤直至几乎无滤渣残留，合并滤液。将铁皮石斛浆液分装于三角瓶，置于灭菌锅中，110 ℃灭菌10 min，取出冷却备用。
　　1.2.3  发酵剂的制备  将冰箱中保藏的植物乳杆菌（LP）、保加利亚乳杆菌（LB）分别接种两环到10%脱脂乳培养基中，42 ℃恒温培养到凝乳，同条件转接3～4次直到凝乳稳定，随后依次接种到含有20%、40%、80%的铁皮石斛汁脱脂乳培养基中，最后接入纯的石斛汁中，发酵成熟后，4 ℃冰箱存放作为生产发酵剂。
　　1.2.4  发酵和冷藏  分别接种2%植物乳杆菌发酵剂（LP）、保加利亚乳杆菌发酵剂（LB）以及混合发酵菌剂（体积比LP∶LB=1∶1）于灭好菌的石斛汁中，42 ℃恒温培养6 h即得发酵饮料，4 ℃冰箱冷藏。同时以不接种菌剂作为原汁对照（CK）。
　　1.2.5  测定指标及方法  多糖含量的测定采用苯酚硫酸法[16];石斛碱的测定采用酸性染料比色法[17];总酚含量用福林酚法[18]测定;总黄酮含量用分光光度法[19]测定;DPPH自由基清除能力参考刘静等[20]的方法测定;羟基自由基清除能力采用邻二氮菲Fe2+氧化法测定[21];超氧阴离子清除能力采用邻苯三酚自氧化法[22]测定。
　　1.3  数据处理
　　采用Origin 2017软件对数据进行统计和差异显著性分析（P<0.05）
　　2  结果与分析
　　2.1  乳酸菌发酵对多糖含量的影响
　　从图1可知，经乳酸菌发酵后，铁皮石斛汁中的多糖含量比原汁均有所降低，采用2种乳酸菌及其组合进行发酵，对多糖含量的变化均有显著性差异（P<0.05）。利用植物乳杆菌和保加利亚
　　乳杆菌分别发酵铁皮石斛汁，多糖含量分别比原汁降低了41.63%和41.43%，而保加利亚乳杆菌与植物乳杆菌以1∶1的配比进行发酵时，石斛汁中的多糖含量从原来的5.02%降至3.82%，降低23.9%。从实验结果来看，发酵菌种对石斛汁中的多糖含量有较大影响，单菌种发酵对铁皮石斛汁中多糖含量的消耗较大，复合菌种降低了对多糖的消耗。
　　2.2  乳酸菌发酵对石斛碱含量的影响
　　对发酵前后样品中石斛碱含量进行测定，结果如图2所示。发酵后与发酵前相比，石斛碱的
　　含量略有下降，其中以1∶1配比的混合菌接种发酵后的石斛碱含量减少最大，减少量在4.92%左右。减少的部分可能是乳酸菌生长活动产生的代谢产物对石斛碱有降解作用，或者是乳酸菌利用石斛碱并将其转化成其他的物质，使其含量有所变化。从实验结果来看，总体上乳酸菌对石斛碱含量的影响不大，与未发酵的石斛汁几乎相近，采用2种乳酸菌及其组合发酵石斛汁后对石斛碱含量的变化均无显著性差异（P>0.05）。
　　2.3  乳酸菌发酵对总酚含量的影响
　　对发酵前后的样品液进行总酚含量的测定，结果如图3所示。经乳酸菌发酵后发酵液中的酚类物质含量均有所提高。单菌种发酵条件下，植物乳杆菌发酵液比未发酵原汁的总酚含量显著提高9.02%（P<0.05）;保加利亚乳杆菌发酵液比未发酵原汁的总酚含量显著提高5.62%（P<0.05）;混合菌发酵条件下，总酚含量由发酵前的0.228%提高到0.283%，提高24.17%，差异显著（P<0.05）。以上结果说明，利用乳酸菌发酵铁皮石斛汁能有效提高酚类物质的含量，且多菌混合发酵效果优于单一菌种。乳酸菌在繁殖过程中由于生理代谢产生的一些酶类对铁皮石斛细胞壁结构产生分解作用，细胞壁中的酚类物质能更好地溶解释放出来，从而使发酵汁中酚类物质含量增加。 　　2.4  乳酸菌发酵对总黄酮含量的影响
　　铁皮石斛含有多种黄酮类化合物，由于分子量小，易被人体吸收，参与人体多种生理代谢活动，具有较强的抗氧化能力。由图4可知，乳酸菌发酵后的石斛汁较发酵前总黄酮含量有所提高，植物乳杆菌发酵对黄酮含量提高效果略优于保加利亚乳杆菌，2种菌种混合使用效果更好。与原汁相比，植物乳杆菌对总黄酮含量有显著提高（P<0.05），保加利亚乳杆菌对黄酮含量的提高无显著差异（P>0.05）。在保加利亚乳杆菌与植物乳杆菌混合发酵条件下，总黄酮含量从发酵前的1.265%提高到1.669%，提高31.87%，差异性显著（P<0.05）。
　　2.5  乳酸菌发酵对DPPH自由基清除能力的影响
　　DPPH自由基是一种稳定的自由基，清除剂能与其进行电子配对而逐渐消失。由图5知，在实验使用浓度范围内，铁皮石斛汁对DPPH自由基的清除能力与使用剂量大小有一定的相关性。低浓度下，石斛原汁与发酵汁对DPPH自由基的清除率无明显差异，随着使用剂量的增加，清除率逐渐有所差异。在使用剂量大于0.8 mL时，保加利亚乳杆菌与植物乳杆菌混合发酵对DPPH自由基的清除率明显高于单一菌种发酵，且与原汁相比，差异性显著（P<0.05）。植物乳杆菌单独发酵对DPPH自由基的清除能力与保加利亚乳杆菌单独发酵时相近，几乎无差别，与原汁相比，两者对DPPH自由基清除能力均无显著性差异（P>0.05）。总体上看，石斛乳酸菌发酵液对DPPH自由基的清除率高于石斛原汁。
　　2.6  乳酸菌发酵对羟基自由基清除能力的影响
　　羟基自由基具有很强的氧化能力，过多的羟基存在能够对人体造成极大的伤害。铁皮石斛汁发酵前后对羟基自由基的清除能力如图6所示。在实验剂量范围内，铁皮石斛原汁对羟基自由基的清除能力随着使用剂量增加呈上升趋势，但增幅不大;石斛發酵汁在使用剂量较低时清除能力增加不明显，随着剂量的加大，对羟基自由基的清除能力逐渐有差异。植物乳杆菌单独发酵对羟基自由基的清除能力整体上比保加利亚乳杆菌单独发酵的效果略优，与原汁相比，植物乳杆菌发酵对羟基自由基清除能力有显著性差异（P< 0.05）。混合菌发酵在低剂量时（≤0.4 mL）对羟基自由基的清除能力与单菌种发酵无差别，甚至低于单菌种发酵;在使用剂量较大时（>0.4 mL）混合菌发酵对羟基自由基的清除能力逐渐高于单菌种发酵。与原汁相比，采用保加利亚乳杆菌与混合菌种发酵对羟基自由基的清除能力均无显著性差异（P>0.05）
　　2.7  乳酸菌发酵对超氧阴离子自由基清除能力的影响
　　如图7所示，在实验所用剂量范围内，随着剂量的增加，铁皮石斛原汁和发酵汁对超氧阴离子的清除能力均逐步提高。在使用剂量达到1.2 mL后，铁皮石斛原汁对超氧阴离子的清除能力增强趋势不明显，几乎呈平稳状态;经混合菌发酵后的石斛汁，随着剂量的增加，清除能力逐步增强。植物乳杆菌发酵后清除效果与保加利亚乳杆菌几乎相近，无明显差别;混合菌发酵对超氧阴离子的清除能力比单一菌种强。从总体上看，发酵汁对超氧阴离子的清除能力始终优于石斛原汁。产生此现象可能是发酵汁中黄酮类物质含量差异导致，黄酮类物质对超氧阴离子清除具有较密切的相关性。与原汁相比，单菌种与混合菌种发酵对超氧阴离子的清除能力均有显著性差异（P<0.05），其中混合菌种发酵差异极显著（P< 0.01）。
　　3  讨论
　　铁皮石斛是名贵的传统中药材，具有极高的药用价值，富含石斛多糖、生物碱、氨基酸等活性物质，其中以活性多糖为主，植物活性多糖具有良好的抗氧化能力[23-25]，每一种活性物质都有其特殊的保健功效。目前国内铁皮石斛产品以微粉、浸膏、提取物以及护肤品为主导[26]，大部分仍属于初级加工产品，产品附加值低，更新慢，导致近几年来铁皮石斛市场不景气。因此，开发一款方便使用，同时具有高保健价值的产品是当前石斛产业亟待解决的问题。乳酸菌对人体健康、胃肠道功能、人体免疫力等具有改善作用，有较好的抗菌作用和抗衰老作用[27]。国内乳酸菌应用技术已相当成熟，但相应的产品标准、管理还不够完善，乳酸菌市场还比较混乱，如何使乳酸菌产品市场规范化是目前乳酸菌行业发展的重中之重。
　　多糖是铁皮石斛有效物质的代表，含有多种生物学活性，对肿瘤抑制、血糖降低以及人体免疫功能调节具有一定的辅助作用。除此之外，铁皮石斛多糖还具有抗衰老、抗氧化等功效。目前，对铁皮石斛多糖的研究主要集中在结构组成、含量、提取纯化工艺以及生理活性方面，在加工应用方面相对较少。本研究发现，利用乳酸菌发酵与铁皮石斛原汁相比多糖含量均有所降低，其中减少量最大为植物乳杆菌发酵，相比原汁减少了41.63%。其次为保加利亚乳杆菌，减少量为41.43%，植物乳杆菌与保加利亚乳杆菌按比例1∶1混合发酵，多糖减少量为原汁的23.90%。乳酸菌利用发酵底物的糖分作为碳源生长繁殖，并且在繁殖过程中分泌乳酸、酶等代谢产物。植物性多糖对乳酸菌的生长有一定的促进作用[28]，乳酸菌能将简单的植物性多糖水解成葡萄糖、半乳糖等单糖，再利用这些单糖合成胞外多糖。铁皮石斛多糖具有相当复杂的结构，目前对植物性多糖的一级结构和高级结构以及对乳酸菌的胞外多糖作用机理的研究尚少，还有待深入研究。
　　石斛碱也是铁皮石斛的重要活性成分，是石斛质量评判的参考物质之一，石斛碱在石斛中含量较少，但其功能却相当强大。据研究报道，石斛碱具有降血糖[29]、抗白内障[30]、改善记忆力减退[31]等作用，此外还具有镇痛、解热、促进胃液分泌、助消化[32]等功能。本研究中，经不同乳酸菌发酵过后，石斛汁中总生物碱含量有所降低，其中以植物乳杆菌与保加利亚乳杆菌混合发酵时含量最低，比原汁减少了4.92%。石斛碱的减少可能是乳酸菌的代谢活动产生的酶类对其产生了降解，或是改变了其结构特性，使其含量降低。 　　总酚和总黄酮是植物体中具有良好抗氧化功能的一类物质。本研究发现，经乳酸菌发酵后的铁皮石斛汁总酚、总黄酮含量均比未发酵的石斛汁高，且不同乳酸菌对总酚和总黄酮含量提高程度不同。采用植物乳杆菌发酵铁皮石斛汁，总酚含量高于保加利亚乳杆菌发酵，这可能与植物乳杆菌的菌种特性有关，其分泌的乳酸及生物酶类对铁皮石斛细胞壁的分解能力优于保加利亚乳杆菌，使得铁皮石斛细胞中的酚类物质能更多的释放出来。混合菌种发酵发挥了2种乳酸菌各自的优势，相互促进，使得石斛中的营养物质能够更好的释放出来。由此可见，利用微生物发酵提取植物活性物质的技术是可行的。
　　铁皮石斛抗氧化能力与其活性物质的含量有一定的相关性，且与使用剂量呈一定的线性关系。在实验所用剂量范围内，低剂量时，铁皮石斛原汁与发酵汁对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力无明显区别，但随着剂量的加大，铁皮石斛发酵汁对羟基自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力均比未发酵的石斛汁高，这与发酵前后多酚和总黄酮的变化情况相符。从研究结果上看，乳酸菌发酵铁皮石斛汁过程中虽然消耗了少量的石斛多糖用于生长繁殖，但提高总酚、总黄酮等物质的溶出率，发酵液整体抗氧化能力较发酵前有所提高，在铁皮石斛功能食品上面有一定的应用价值。
　　铁皮石斛的价值决定其产品的市场定位必须高端化，但目前铁皮石斛处于供过于求的状态，深加工产品缺乏，产品形式急需更新。乳酸菌的发酵技术在国内外已相当成熟，目前较多的集中在果蔬、酸奶、面食以及饲料应用方面，在食药两用植物中利用乳酸菌发酵的研究报道还较少。乳酸菌发酵能提高食药两用植物抗氧化能力，并且风味、口感均较好，可进行深加工研究以丰富铁皮石斛产品，亦可利用微生物对铁皮石斛有效成分进行提取和改造，生产出更加高效的保健产品。
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