苦丁茶不同提取物抗氧化活性比较及其GC-MS分析
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摘 要：利用气相色谱质谱联用技术（GC-MS），对苦丁茶超声辅助不同有机溶剂（乙醇、乙酸乙酯、石油醚）提取物及超临界CO2萃取物的体外抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除活性、超氧阴离子自由基清除活性和ABTS+自由基清除能力）进行比较分析。结果表明，苦丁茶不同提取物DPPH清除能力和超氧阴离子自由基清除活性依次为：超声乙醇提取物>超临界CO2萃取物>超声乙酸乙酯提取物>超声石油醚提取物，羟基自由基和ABTS+自由基清除能力依次为：超声乙醇提取物>超声乙酸乙酯提取物>超临界CO2萃取物>超声石油醚提取物。GC-MS结果显示，苦丁茶不同提取物中主要有5类物质，共有49种化学成分，7种共有成分。
关键词：苦丁茶;提取物;超临界CO2;体外抗氧化活性;气相色谱-质谱
中图分类号：R284.1;Q946.91 文献标识码：A
Antioxidant Activities and GC-MS Analysis of Ilex kudingcha C.J. Tseng Extracts by Different Extraction Methods
ZHU Kexue1，2， DAO Chunli1，3， GU Wenliang1， XU Fei1， TAN Lehe1，2*
1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Hainan Provincial Engineering Research Center for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 3. College of Tropical Crop Science， Yunnan Agricultural University， Pu’er， Yunnan 665000， China
Abstract： The present study was aimed to compare the effects of the extracts of Ilex kudingcha C.J. Tseng with different organic solvents （ethanol， ethyl acetate， petroleum ether） assisted by ultrasound and supercritical CO2 extraction against oxidation activities （DPPH·） scavenging activity， hydroxyl radical （·OH） elimination activity， superoxide anion free radical （O2·） scavenging activity and ABTS+· radical elimination ability）， and component analysis by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The DPPH· and O2· scavenging abilities were as follows： ultrasound-ethanol extract > supercritical CO2 extract > ultrasound-ethyl acetate > ultrasound-petroleum ether extract. The OH· and ABTS+· radical scavenging abilities were as follows： ultrasound-ethanol extract > ultrasound-ethyl acetate extract > supercritical CO2 extract > ultrasound-petroleum ether extract. GC-MS analysis showed that there were five main types of substances in the four different extraction methods， a total of 50 chemical components and seven common components.
Keywords： Ilex kudingcha C.J. Tseng; extracts; supercritical CO2; in vitro antioxidant activity; GC-MS
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.022
苦丁茶（Ilex kudingcha C.J. Tseng）又稱皋卢茶，是冬青科常绿乔木，在我国已有2000多年饮用历史，为我国民间重要的“特色茶”、“代用茶”，是我国南方常饮茶叶之一[1]。我国长江流域以南地区已有31种被称作苦丁茶的植物，市面上常见的苦丁茶主要为冬青科和木犀科[2]。苦丁茶中富含多种生物活性组分，如多酚、黄酮、多糖、氨基酸、三萜和皂苷等，具有显著的抗氧化、降血脂、抑菌等生理功效，近年来受到越来越多研究学者的关注[3]。苦丁茶中的多酚与黄酮类等活性物质不仅能够作为食品的抗氧化剂，还可在食物油中逐渐溶解，可辅助减缓人体衰老[4]。现今，苦丁茶被应用于食品和药品行业，成为人们日常生活中的一种天然植物饮料，长期饮用苦丁茶，具有良好的保健作用[5-6]。 苦丁茶组分提取方法常见有热水浸提[7]、超临界CO2流体萃取[8]和超声波法提取[9]等。其中超声波辅助提取主要利用超声波使提取物发生连续混合摇匀，利于溶质与溶液间相互作用，可减少提取时间和增加有效成分的提取率，提高原料的利用率;而超临界CO2流体萃取具有温度易控制、循环周期短等优点。刘祖生等[11]利用高效液相色谱法鉴定苦丁茶中黄酮类物质，发现多数苦丁茶样品中含有杨梅苷、槲皮素和芦丁3种成分，在苦丁茶冬青中其成分的含量占有较大的比率。此外，张倩茹等[12]通过利用水蒸气蒸馏法对贵州4种产地（正安、新舟、绥阳、湄潭）的苦丁茶（女贞属）挥发油进行提取，并结合GC-MS分离鉴定，得出在4种苦丁茶样品所提取出挥发油因产地不同，苦丁茶挥发油所含有的化学组分也存在着较大的差异。熊波等[13]通过有机溶剂（乙醚）超声提取并结合蒸馏提取其所含挥发油，利用GC-MS分析对海南冬青苦丁茶的嫩叶进行挥发成分研究，共鉴定出57个成分，主要成分为醇类、醛类、酮类、醚类等化合物。可见，苦丁茶提取物具有较强的抗氧化性，主要与其中含有的多酚、黄酮等物质含量有关。
本研究以海南产苦丁茶冬青为研究对象，采用超声辅助有机溶剂浸提及超临界CO2萃取进行苦丁茶组分提取，评价不同提取物的体外抗氧化活性;采用GC-MS技术对不同提取物中挥发性风味物质进行定性分析，研究结果可为苦丁茶活性组分高值化应用提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 苦丁茶冬青由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供。DPPH（纯度≥98%）和邻苯三酚（纯度≥98%）购自美国Sigma公司;无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、双氧水均为分析纯试剂，购自西陇化工股份有限公司;邻菲罗啉、硫酸亚铁、抗坏血酸等均为国产分析纯试剂;磷酸氢二钠为广州牌分析纯;磷酸二氢钠为分析纯，购于广东光华化学厂有限公司。
1.1.2 仪器与设备 SFE-2型超临界CO2萃取仪，美国Applied Separations（ASI）公司;R-215型旋转蒸发仪，瑞士步琪实验设备公司;SB-5200DT型超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司;750T型多功能粉碎机，铂欧五金厂;N-EVAP12型氮吹仪，美国Organomation公司;ME4002E型电子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;SPECORD 250PLUS型紫外/可见分光光度计，德国耶拿公司;7890A气相色谱-质谱，美国安捷伦公司。
1.2 方法
1.2.1 超声辅助有机溶剂浸提 称取一定量苦丁茶粉置于螺口棕色玻璃瓶中，分别加入无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚，超声时间30 min后常温下避光浸泡12 h，过滤、收集滤液，旋转蒸发仪旋蒸至5～10 mL，氮吹干备用。
1.2.2 超临界CO2萃取 称取一定量苦丁茶粉末，纱布包裹置于萃取壶，设定温度为70 ℃、压力为35 MPa，萃取2 h收集萃取物。
1.2.3 DPPH自由基（DPPH·）清除活性 参照朱科学等[14]方法并稍作修改：量取1.0 mL不同方法提取物溶液（1.0 mg/mL），滴入0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液3.0 mL，置于10 mL试管，混合均匀，并在室内避光保存半小时，于517 nm处测定各管反应液吸光度，重复3次。计算公式如下：
（1）
式中：Ai是不同方法提取物溶液的吸光度、Ac是用无水乙醇代替样品的吸光度。
1.2.4 羟基自由基（·OH）清除活性 参照Zhu等[15]方法并稍作修改：在样品组、空白组和对照组中按顺序加入配制好的1.0 mL磷酸盐缓冲液，1.0 mL邻菲罗啉，1.0 mL用不同方法提取物溶液（1.0 mg/mL），1.0 mL硫酸亚铁和0.5 mL 0.01% H2O2，反应混合物在恒温条件下（37 ℃）水浴反应1 h后，测其536 nm处各样品反应液的吸光度值。计算公式如下：
（2）
式中：A0是对照组的吸光度（用无水乙醇代替）、A1是空白组的吸光度（用无水乙醇代替样品和H2O2）、A2是样品的吸光度。
1.2.5 超氧阴离子自由基（O2·）清除活性 参照Thuong等[16]方法配制反应体系，试管中加入4.5 mL缓冲溶液（Tris-HCl），置于25 ℃水浴锅中水浴20 min，加0.4 mL苦丁茶不同提取物溶液（1.0 mg/mL）和0.08 mL邻苯三酚溶液（需在25 ℃保温），混合均匀，测其325 nm处的吸光度值，并每隔0.5 min记录1次吸光度值，连续读4 min。对照为空白，空白管中的邻苯三酚溶液换为HCl（10 mmol/L），以空白做参比。计算公式如下：
（3）
（4）
式中：An是空白或样品吸光度最后1次记录值、A1是空白或样品吸光度第1次记录值、V1是空白管氧化速率、V2是样品管氧化速率。
1.2.6 ABTS+自由基清除能力 参照Sridhar等[17]方法配制反应溶液，ABTS+工作液需用蒸馏水稀释，并且在734 nm下测其吸光度值必须为0.70± 0.02。取0.25 mL苦丁茶不同提取物溶液（1.0 mg/mL）与4.75 mL ABTS+工作液混合均匀，置于10 mL试管中，放置6 min，测734 nm处吸光度值，阳性对照为抗坏血酸（Vc）。以无水乙醇做参比。计算公式如下：
（5）
式中：A0为空白对照吸光度值、Ai为样品组吸光度值、Aj为样品本底吸光度值。 1.2.7 气相色谱-质谱 分别称取0.15 g提取物，加入2850 mL正己烷，溶解、摇匀，有机滤膜过滤，GC-MS进样分析。色谱条件：色谱柱为石英毛细管柱DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 mm），苦丁茶色谱柱的程序升温条件为60 ℃保持12 min，以6 ℃/min到260 ℃，保持30 min;载气为He;分流比为1∶50;进样温度设为250 ℃;质谱条件：扫描方式为EI源;离子源温度设置为230 ℃;检测器电压为1.25 kV;扫描时间为0.5 s。
1.3 数据处理
数据处理采用Excel 2010、Origin 9.0、SPSS 20.0等软件完成。数据结果以平均值标准差（±s）表示，并采用Origin 9.0软件绘图。采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），P<0.05时表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 DPPH·清除能力
如图1所示，不同提取方法制备的苦丁茶提取物DPPH·清除能力不同，且清除率差异显著。其中，超声辅助乙醇提取物清除能力最强，清除率达到98.12%，其次是超临界CO2萃取物，清除率为23.53%，相比之下超声辅助石油醚提取物的清除作用是最小的，清除率为1.43%。由实验结果可知，苦丁茶不同提取物对DPPH·的清除作用排序为：超声乙醇提取物>超临界CO2萃取物>超声乙酸乙酯提取物>超声石油醚提取物。
2.2 ·OH清除能力
由图2可知，苦丁茶不同提取物具有良好的·OH清除能力，但不同提取物间差异较大。其中，超声辅助乙醇提取物清除能力最强，清除率达到66.91%，其次是超声辅助乙酸乙酯提取物，清除率为61.48%，这2种苦丁茶提取物的·OH清除率无显著差异;超声辅助石油醚提取物的清除作用是最小的，清除率仅为26.86%，与其他3种不同提取物均呈现显著差异;苦丁茶不同提取物对·OH的清除作用由强到弱依次为：超声乙醇提取物>超声乙酸乙酯提取物>超临界CO2萃取物>超声石油醚提取物。
2.3 O2·清除能力
以O2·清除率作为考察苦丁茶不同提取物抗氧化活性的指标之一。图3结果显示，不同方法制备的苦丁茶提取物O2·清除能力具有显著差异，超声辅助乙醇提取物的清除率最高，达87.27%，超声辅助乙酸乙酯和石油醚提取物的清除能力较低（两者无显著差异），分别为38.26%和35.72%。由结果可知，苦丁茶不同提取物对O2·的清除作用由强到弱依次为：超声乙醇提取物>超临界CO2萃取物>超声乙酸乙酯提取物>超声石油醚提取物。
2.4 ABTS+·清除能力
图4表示苦丁茶不同提取物对ABTS+·清除能力，结果显示，不同提取方法制备的苦丁茶提取物对ABTS+·清除能力具有显著差异。其中，超声辅助乙醇提取物的清除率最高，达97.48%，超声辅助石油醚提取物清除能力最低，为5.82%，苦丁茶不同提取物对ABTS+·清除作用由强到弱依次为：超声乙醇提取物>超声乙酸乙酯提取物>超临界CO2萃取物>超声石油醚提取物。
2.5 苦丁茶中的组分分析
GC-MS组分分析结果显示（表1），苦丁茶不同提取物中含49种挥发性物质，主要为烷烃类、酯类、烯烃类、酸类等5类物质。超声辅助乙酸乙酯提取物、超声辅助石油醚提取物、超临界CO2萃取物和超声辅助乙醇提取物各鉴定出30、20、21和16种成分，7种共有成分，分别是：乙酸正十七烷基酯、2-溴十六烷酸、油酸、新植二烯、6，11-二甲基-2，6，10-十二碳三烯、聚酰胺樹脂、9，17-十八二烯醛。
3 讨论
DPPH是一种稳定的自由基，其单电子可被自由基清除剂配对，通过颜色的变浅程度与配对电子数成剂量关系评价自由基的清除情况，DPPH·清除能力常被国内外用来测定是否含有抗氧化活性的方法[18]。Liu等[5]对苦丁茶冬青中多酚含量及其抗氧化活性进行分析，研究发现，不同溶剂提取的苦丁茶多酚组分均具有显著抗氧化活性。Thuong等[16]分析苦丁茶乙酸乙酯提取组分对DPPH·清除的清除作用，结果显示，提取组分具有良好的自由基清除能力。本研究发现，苦丁茶不同提取组分具有良好的DPPH·清除能力，且清除率相差较大，研究结果与文献报道相一致。
·OH属于活性氧化物，能够降解生物体内DNA、蛋白质和多糖化合物，继而诱发一系列有害效应。朱科学等[19]报道，苦丁茶中石油醚萃取物主要是脂质类物质，乙酸乙酯萃取物主要为酚类和黄酮类。而乙醇提取组分主要有脂溶性多酚等物质[20]，超临界萃取技术提取的有效成分主要包括黄酮类化合物、糖苷类化合物、生物碱、萜类化合物、香豆素等物质[21]。本研究发现，苦丁茶不同提取物具有较高的·OH清除率，推测其对·OH的清除作用与组分成分可能有潜在的关联性。
O2·是生物体代谢中产生的一种重要的活性氧自由基，其引起的机体生命代谢过程中脂质过氧化是机体衰老、心血管疾病及肿瘤发生的重要原因[22]。Nagai等[23]对马尾（问荆L.）水提取物和醇提物的抗氧化活性研究，发现水提物和醇提物均具有O2·清除活性，其中醇提物清除率为40%，水提物清除率为93%，表明其天然提取物可用于功效食品的研发应用。Li等[24]对超临界CO2萃取莲子心油的体外抗氧化活性进行研究，发现莲子心油可清除自由基，70 mg/mL剂量时清除率为25%。本研究结果与报道相一致：不同方法制备的苦丁茶提取物具有明显的O2·清除能力。
ABTS+自由基脱色试验是一种广泛用于评价生物样品抗氧化活性的方法。张文芹等[25]比较，大叶冬青苦丁茶与苦丁茶冬青苦丁茶多酚与黄酮含量、自由基清除能力，结果发现，冬青苦丁茶水提液和大叶冬青苦丁茶水提液均具有ABTS+清除作用，冬青苦丁茶提取液的清除能力比大叶冬青苦丁茶提取液的稍强。吕雨晴等[26]以DPPH·清除能力、ABTS自由基清除能力、还原能力为抗氧化能力的评价指标，比较超声波提取法、微波辅助提取法、索氏提取法、回流提取法和浸渍提取法分别提取苦丁茶黄酮的抗氧化活性，结果表明，不同提取方法造成提取物中黄酮结构破坏程度不同，抗氧化活性存在差异。本研究结果与现有报道相一致。 大量文献报道表明，不同提取方法制备的苦丁茶提物的化学组分具有明显差异。黄双莲[27]采用乙醇浸取法、乙醚浸取法、蒸馏萃取法和超声波辅助蒸馏萃取法提取苦丁茶中香气成分，并用GC-MS进行分析，结果表明：超声辅助蒸馏萃取法提取苦丁茶香气成分效果较好，GC-MS初步鉴定出19种香气成分，主要为烯酮类、萜类、醇类、酯类、烯径类与杂环化合物等。本研究对苦丁茶冬青4种不同提取物进行GC-MS分析发现，样品中主要有烷烃类、酯类、烯烃类、酸类与其他类5类物质，主要以烷烃类和酯类为主，共有49种化学组分。
综上所述，苦丁茶冬青作为海南省一张特产名片，其在抗氧化和抗衰老等功能产品研发方面具有广阔的应用前景。因此，本研究开展苦丁茶不同方法提取物抗氧化活性评价、风味组成鉴定研究，实验结果可为苦丁茶天然抗氧化剂等产品的开发提供依据。
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