枳椇子黄酮的体外抗氧化活性研究

来源:用户上传      作者:

　　摘要 通过70%乙醇提取制得粗黄酮浸膏（黄酮含量为7.75%），且对粗黄酮浸膏进行初步纯化得到精制黄酮浸膏（黄酮含量为20.87%），以L-抗坏血酸棕榈酸酯为阳性对照，比较2种黄酮清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基能力。结果表明，当浓度在0.05～0.25 mg/mL时，粗黄酮和精制黄酮对DPPH自由基清除率高达90%左右，而L-抗坏血酸棕榈酸酯清除率最高为77.34%。当浓度在0.40～2.00 mg/mL时，3种样品溶液对超氧阴离子自由基的清除率从大到小依次为精制黄酮、粗黄酮、L-抗坏血酸棕榈酸酯。浓度为2.00 mg/mL时，粗黄酮、精制黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯对羟自由基的清除率分别为22.41%、36.03%和33.68%。总之，枳椇子黄酮对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基有较强的清除效果和较好的体外抗氧化活性。
　　关键词 枳椇，黄酮，抗氧化活性，自由基
　　中图分类号 TS201.1文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）06-0152-04
　　Abstract A crude flavonoid extract （flavonoid content of 7.75%） was prepared by 70% ethanol extraction，and crude flavonoid extract preliminary give purified flavonoid extract （flavonoid content of 20.87%），Lascorbyl palmitate was used as a positive control，the scavenging ability of two flavonoids on DPPH free radicals，superoxide anion free radicals and hydroxyl free radicals was compared.When the concentration within 0.05-0.25 mg/mL，the crude flavones and the purified flavones on DPPH free radical clearance rate was as high as 90%，and L-ascorbic acid palmitate clearance rate was as high as 77.34%.When the concentration within 0.40 - 2.00 mg/mL，the size of three kinds of sample solution to the superoxide anion free radical clearance rate was purified flavones>crude flavones>L-ascorbic acid palmitate.When the concentration was 2.00 mg/mL，the crude flavones，purified flavones and L-ascorbic acid palmitate to hydroxyl free radical clearance rate was 22.41%，36.03% and 33.68%，respectively.In short，the flavonoids of Hovenia acerba have strong scavenging effects on DPPH free radicals，superoxide anion free radicals and hydroxyl free radicals，and have good antioxidant activity in vitro.
　　Key words Hovenia acerba Lindl.，Flavonoids，Antioxidant activity，Free radical
　　枳椇（Hovenia acerba Lindl.），为鼠李科枳椇属落叶阔叶高大乔木，是园林绿化树种，其木材可做家具，树皮、叶、根、果实、种子均可药用，有极大的开发利用价值[1]。我国枳椇种植面积辽阔，栽培品种多样，产量大，资源丰富。枳椇鲜果、干果可直接食用，枳椇子有保肝护肝的药理作用[2]。枳椇子主要含生物碱、黄酮[3]、皂苷[4]、有机酸、葡萄糖类等成分，其可以开发多种功能性食品[5-6]。现代医学研究表明，黄酮类物质具有降低心肌耗氧量、增加冠状动脉和脑血管中血流量、抗心律失常、软化血管、降低血糖和血脂、解酒护肝和增强机体免疫力等功能[7-8]，同時在胃肠道中更发挥了重要的作用，包括抗氧化、抗炎、抗癌、调节肠道菌群等多种功能活性[9]。枳椇子即枳椇的种子，枳椇子中黄酮类物质含量较高，具有良好的抗氧化功能[10]，已有文献指出，可采用超声波辅助酶法[11]、超声波辅助乙醇浸提法[12]、超临界流体萃取、微波辅助提取、加压液提取、脉冲电场辅助提取、绿色溶剂提取、蒸汽爆破辅助提取及动态微流化辅助提取[13]等方法对黄酮进行提取，并利用响应面法在单因素试验结果之上再做优化试验[12]。枳椇子黄酮含量高，且目前对枳椇子黄酮体外抗氧化活性的研究报道较少，所以系统研究枳椇子黄酮清除自由基、减缓衰老的药理活性具有重要意义。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　枳椇子，购于安国药材市场，产地湖北，L-抗坏血酸棕榈酸酯，Amresco公司，二苯苦味酰基自由基（DPPH·），Singma公司，芦丁对照品、无水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、甲醇、三羟基氨基甲烷、邻苯三酚、盐酸、水杨酸、FeSO4·7H2O、H2O2等试剂均为国产分析纯。 　　1.2 试验仪器
　　RE-52A型旋转蒸发器，上海亚荣仪器厂，SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城工贸有限公司，HWS-12型电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司，KQ5200 DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司，AR1140型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司，UV-1000型紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司，1-PHASINDUCITON型粉碎机，泓荃制药有限公司，规格0-100型3支组酒精计，余姚仪表工厂有限责任公司。
　　1.3 枳椇子黄酮的提取与精制工艺流程[14] 见图1。
　　1.4 枳椇子黄酮含量测定
　　1.4.1 芦丁标准曲线的绘制。精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品20 mg，80%乙醇溶解后定容于50 mL容量瓶中，配成浓度为0.40 mg/mL的对照品溶液，精取上述对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置25 mL比色管中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10%Al（N03）3溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加入4%NaOH溶液10.0 mL，用80%乙醇稀释至刻度，混匀。放置15 min，在500 nm波长处，以相应试剂作空白，分别测吸光度[15]，计算得出标准曲线。
　　1.4.2 黄酮含量的测定。
　　分别称取0.200 g粗黄酮浸膏、精制黄酮浸膏，用80%乙醇溶解后定容于100 mL容量瓶中作为样品液。取4.0 mL样品置25 mL比色管中，后续方法同“1.4.1”。将测得的吸光度代入标准曲线公式，得到样品中黄酮的浓度，再计算出粗黄酮、精制黄酮浸膏中黄酮的含量。
　　1.5 枳椇黄酮体外抗氧化活性研究
　　1.5.1 对二苯苦味酰基自由基（DPPH·）的清除试验。DPPH·清除法是一种筛选自由基清除剂评价抗氧化活性的简便方法。其分析原理是：DPPH·是一种稳定的自由基，其结构中含有3个苯环，1个N原子上有1个孤对电子，其甲醇溶液呈紫色，在517 nm附近有强吸收，当DPPH·溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，颜色由紫色向黄色变化，在517 nm处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈定量关系，可用清除率（P）表示，P值越大，抗氧化能力越强[16-17]。
　　样品溶液的制备及操作步骤如下：精确称取枳椇子粗黄酮、精制黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯（阳性对照），均配制成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 5个浓度的待测液。试验分调空白、空白组、样品组、本底组4个平行组。空白组是2 mL 70%乙醇加入2 mL 0.1 mg/mL DPPH-甲醇溶液，混匀，避光反应30 min，样品组是2 mL不同浓度样品溶液加入2 mL 0.1 mg/mL DPPH-甲醇溶液，反應条件同空白组，本底组排除样品溶液颜色干扰，将2 mL不同浓度样品溶液中加入2 mL甲醇溶液，反应条件与空白组相同，另外用2 mL 70%乙醇和2 mL甲醇的混合溶液作为调空白。反应完成后，在517 nm波长下测吸光度，每组平行3次，根据公式计算：
　　P=Ao-（Ai-Aj）Ao×100%（1）
　　式中，P为清除率 ，Ao为空白吸光度，Ai为样品组吸光度，Aj为本底组吸光度。根据计算结果，绘制枳椇子粗黄酮、枳椇子精制黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯对DPPH自由基清除效果的比较曲线。
　　1.5.2 对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除试验。邻苯三酚自氧化法是测定清除O2·-活性的常用方法[18-20]，该试验采用此方法。样品溶液的制备及操作步骤为：精确称取枳椇子粗黄酮、精制黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯，均配制成0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mg/mL 5个浓度的待测液。试验分调空白、空白组、样品组、本底组。空白试管中依次加入4.5 mL 0.05 mol/L Tris-Hcl、0.1 mL 70%乙醇、0.4 mL 2.5 mmol/L邻苯三酚，混匀后25 ℃水浴中反应5 min，再加入0.1 mL 8 mol/L Hcl终止反应，样品组将空白组中0.1 mL 70%乙醇换成0.1 mL不同浓度样品溶液，本底组将0.4 mL 2.5 mmol/L邻苯三酚换成0.4 mL 10 mmol/L Hcl溶液，调空白组的混合液是将空白组的邻苯三酚换成超纯水，反应条件均与空白组相同。反应完成后在299 nm波长下测吸光度，每组平行3次，清除率计算公式见式（1），根据结果绘制枳椇子粗黄酮、枳椇子精制黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯对超氧阴离子自由基清除效果的比较曲线。
　　1.5.3 对羟自由基（·OH）的清除试验。
　　·OH是一个具极强氧化能力的基团。其半衰期为9～10 s，它可通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变，·OH还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关[21]，所以羟自由基清除率是反映抗氧化功能的重要指标。该试验利用H2O2与Fe2+混合产生羟自由基，即H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+，反应产生的羟自由基进攻水杨酸分子上的苯环，产生2，3-二羟基苯甲酸，通过分光光度法可测定其含量，从而来描述羟基的量及待测物质清除羟基自由基的能力[22]。再在体系内加入水杨酸捕捉羟自由基并产生有色物质。该物质在510 nm处有最大吸收[23]，可用该吸光度来表示羟自由基的含量。
　　试验分4个平行组：调空白、空白组、，样品组、本底组。室温下，取1 mL 1 mmol/L水杨酸-乙醇溶液于试管中，依次加入0.1 mL 0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mg/mL 5个浓度的样品溶液和1 mL 1 mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀，最后加入1 mL新配制的0.01%过氧化氢溶液，在37 ℃下温浴30 min，在510 nm处测吸光度，重复3次所测得数据取平均为样品组的吸光度Ai，同理，本底组用1 mL超纯水代替1 mL 0.01%过氧化氢溶液，操作方法同上，测得510 nm处的吸光度Aj，空白组以1 mL 70%乙醇溶液取代样品组的1 mL样品溶液，操作同上，测得510 nm处的吸光度Ao，调空白用1 mL超纯水代替空白组的1 mL 0.01%过氧化氢溶液，操作方法同上。清除率计算公式见式（1）。绘制枳椇子粗黄酮、枳椇子精制黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯对羟自由基清除效果的比较曲线。 　　2 结果与分析
　　2.1 样品中黄酮的测定
　　从图2可以看出，芦丁浓度与吸光度的线性关系良好（R2=0.999 8），线性回归方程为y=11.518x+0.001 6 。4 mL枳椇子粗黄酮样品溶液测得的吸光度平均值为A=0.287，4 mL枳椇子精制黄酮样品溶液测得的吸光度平均值为A=0.771。枳椇子的总重量为20.007 8 g，提取得到的粗黄酮总浸膏重量为1.550 5 g。根据“1.4.2”方法计算，粗黄酮浸膏中黄酮的含量为7.75%，精制黄酮浸膏中黄酮的含量为20.87%。
　　2.2 对DPPH·的清除作用 从3种样品溶液对DPPH·的作用结果（图3）可以看出，枳椇子粗黄酮、精制黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯对DPPH·均有明显的清除作用。在溶液浓度为0.05～0.25 mg/mL，随着样品浓度的不断增加，3种样品溶液对DPPH·的清除率在不断增大，并且L-抗坏血酸棕榈酸酯对DPPH·清除率增加的最为明显，由21.79%上升至77.34%。枳椇子粗黄酮、精制黄酮对DPPH·的清除率虽然增加但增幅较小，误差波动范围也较小，但清除率一直在85%～92%，说明在0.05～0.25 mg/mL枳椇子粗黄酮、精制黄酮对DPPH·就表现出很高的清除率。由此可见，对DPPH·清除效果枳椇子粗黄酮、精制黄酮好于阳性对照组L-抗坏血酸棕榈酸酯，说明枳椇子粗黄酮、精制黄酮对DPPH·有很强的清除作用，在0.05 mg/mL的浓度时，清除率达85%。
　　2.3 对超氧阴离子（O2·-）的清除作用 从3种样品溶液对O2·-的作用结果（图4）可以看出，枳椇子粗黄酮、精制黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯对
　　O2·-均有明显的清除效果，3种样品溶液都随着浓度的增加对O2·-的清除能力呈线性关系增强。对O2·-的清除能力从大到小依次为精制黄酮、粗黄酮、L-抗坏血酸棕榈酸酯。在样品溶液浓度0.40～2.00 mg/mL，精制黄酮的清除率呈现开始增长缓慢，中间迅速增长，最后又缓慢增长的趋势。粗黄酮清除率的变化趋势是一直缓慢增长，从3.45%增加至10.69%。L-抗坏血酸棕榈酸酯开始增长缓慢而随后趋于平稳，清除率从1.49%上升至4.90%。从清除曲线来看，在
　　样品溶液浓度为0.40～2.00 mg/mL时，精制黄酮对O2·-的清除效果最好，最高达22.89%，但误差波动范围较大。粗黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯对O2·-的清除率一般，最高值分别为10.69%和4.90%，而误差波动范围較小。总体来看，枳椇子精制黄酮对O2·-的清除效果明显优于粗黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯的清除效果，清除率从大到小依次为枳椇子精制黄酮、粗黄酮、L-抗坏血酸棕榈酸酯，说明对O2·-枳椇子粗黄酮、精制黄酮的清除效果比阳性对照L-抗坏血酸棕榈酸酯更强。
　　2.4 对羟自由基（·OH）的清除作用
　　从3种样品溶液对·OH的作用结果（图5）可以看出，在样品溶液浓度为0.40～2.00 mg/mL时，3种样品溶液清除率都呈现明显的量效关系并且清除率与3种样品溶液浓度呈正相关。在浓度为0.40～1.60 mg/mL，对·OH的清除作用从大到小依次为L-抗坏血酸棕榈酸酯、精制黄酮、粗黄酮，粗黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯清除率的误差波动范围比精制黄酮小。在浓度为0.80 mg/mL时，L-抗坏血酸棕榈酸酯的清除率高达24.23%，大于枳椇子粗黄酮（9.24%）与精制黄酮（15.25%）的清除率。在浓度为2.00 mg/mL时，枳椇子精制黄酮的清除率高达36.03%，而枳椇子粗黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯清除率分别为22.41%和33.68%，但是在同浓度下3种溶液对·OH的清除率要远大于对O2·-的清除率。在
　　样品溶液浓度为1.20～2.00 mg/mL时，枳椇子粗黄酮与精制黄酮的清除率呈迅速增长趋势，清除能力越来越强，而L-抗坏血酸棕榈酸酯清除率虽然也在不断增长，但变化不大。分析原因，可能是此时L-抗坏血酸棕榈酸酯的清除能力已经达到饱和。如果溶液浓度继续增大，枳椇子粗黄酮与精制黄酮对·OH的清除能力可能会大于L-抗坏血酸棕榈酸酯。
　　3 结论
　　从试验结果可以看出枳椇子黄酮粗提物与精制黄酮浸膏对DPPH、羟基自由基、超氧阴离子自由基均有较好的清除作用，其浓度的增加与其清除率呈正相关。
　　在样品溶液浓度为0.05～0.25 mg/mL时，枳椇子粗黄酮、精制黄酮对DPPH·的清除率高达90%左右，而L-抗坏血酸棕榈酸酯的清除率仅为77.34%。在样品溶液浓度为0.80 mg/mL 时，L-抗坏血酸棕榈酸酯对羟自由基的清除率为24.23%，大于枳椇子粗黄酮与精制黄酮清除率（分别为9.24%和15.25%），在样品溶液浓度为2.00 mg/mL时，枳椇子精制黄酮的清除率高达36.03%，而枳椇子粗黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯清除率分别为22.41%和33.68%。在样品溶液浓度为2.00 mg/mL时，精制黄酮对超氧阴离子的清除率高达22.89%，而粗黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯清除率最高分别仅有10.69%和4.90%。对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，同浓度下枳椇子粗黄酮和精制黄酮的清除率要远大于L-抗坏血酸棕榈酸酯，样品的清除效果优于阳性对照。当样品溶液浓度为0.40～1.60 mg/mL时，L-抗坏血酸棕榈酸酯对·OH的清除率大于粗黄酮和精制黄酮，当浓度达2.00 mg/mL 时对·OH的清除率精制黄酮比粗黄酮和L-抗坏血酸棕榈酸酯要高。由此可以看出，枳椇子黄酮在一定浓度范围内对自由基的清除率高于L-抗坏血酸棕榈酸酯，具有较高的体外抗氧化活性，所以对枳椇子黄酮的开发利用具有很好的前景。
　　参考文献 　　[1] 时涛，王晓玲，陈振德，等.枳椇子化学成分及其药理活性研究进展[J].中药材，2006，29（5）：510-513.
　　[2] 吴龙火，张剑.枳椇子的化学成分研究[J].时珍国医国药，2013，24（5）：1028-1029.
　　[3] 张凰.枳椇子中总黄酮提取与分离纯化工艺的研究[D].武汉：武汉轻工大学，2014.
　　[4] XU F F，ZHANG X Q，ZHANG J，et al.Two methyl-migrated 16，17-seco-dammarane triterpenoid saponins from the seeds of Hovenia acerba[J].Journal of Asian natural products research，2012，14（2）：135-140.
　　[5] 洪金艳，李洪军，贺稚非，等.解酒保肝活菌饮料的发酵工艺[J].食品与发酵工业，2015，41（7）：86-92.
　　[6] 向进乐.枳椇果梗发酵特性及其果醋功能性研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2012.
　　[7] ECHEVERRY C，ARREDONDO F，MARTNEZ M，et al.Antioxidant activity，cellular bioavailability，and iron and calcium management of neuroprotective and nonneuroprotective flavones[J].Neurotox research，2015，27（1）：31-42.
　　[8] WOZ′NIAK D，DRYS′ A，MATKOWSKI A.Antiradical and antioxidant activity of flavones from Scutellariae baicalensis radix[J].Natural product research，2015，29（16）：1567-1570.
　　[9] 常化松，袁雯雯，玄红专，等.黄酮类化合物吸收代谢及其对胃肠道功能影响的研究进展[J].食品工业科技，2019（18）：340-347.
　　[10] 王彦平，袁贵英，陈月英，等.枳椇子营养成分和总黄酮含量分析及评价[J].食品研究与开发，2016，37（24）：21-24.
　　[11] 张丽霞，魏照辉，赵婉晴.响应面优化超声波辅助酶法提取桑叶总黄酮的工艺[J].江苏农业科学，2019，47（13）：217-221.
　　[12] 谢勇武，谭属琼.响应面法优化超声辅助提取龙眼壳、核中总黄酮工艺[J].江苏农业科学，2019，47（13）：239-244.
　　[13] 萬新焕，陈新梅，马山，等.黄酮类化合物提取新方法的应用[J].中草药，2019，50（15）：3691-3699.
　　[14] 田智勇，柴郑，徐亚菲，等.正交设计优选枳椇子中总黄酮的提取工艺[J].河南大学学报（医学版），2015，34（4）：247-251.
　　[15] 乐薇，吴士筠.热浸法提取箬竹叶总黄酮的动力学试验[J].林业科技开发，2015，29（4）：106-109.
　　[16] 索有瑞.柴达木盆地白刺多糖研究与开发[M].北京：科学出版社，2010：324-325.
　　[17] 黄巧燕，赵文英，戎晋华，等.加压提取菊花中黄酮类成分及其抗氧化活性研究[J].林产化学与工业，2013，33（5）：83-87.
　　[18] 陈志红，徐美奕，龚先玲.紫荆花黄酮类化合物体外抗氧化活性研究[J].化学世界，2010（7）：401-403.
　　[19] 罗堾子，孔永强，张弘，等.密蒙花总黄酮清除自由基活性研究[J].林产化学与工业，2013，32（3）：97-101.
　　[20] 何洁，何芮，严奉伟.鱼腥草总黄酮的提取方法与抗氧化活性研究[J].食品科技，2014，39（3）：198-201.
　　[21] 傅裕.体外抗氧化功能评价方法研究进展[J].肉类研究，2010（11）：41-46.
　　[22] 陈红梅，谢翎.响应面法优化半枝莲黄酮提取工艺及体外抗氧化性分析[J].食品科学，2016，37（2）：45-50.
　　[23] 熊燕飞，赵元昊，杨亚宁，等.构树黄酮的提取及体外抗氧化作用[J].林业科技开发，2009，23（1）：42-45.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15160164.htm