不同干燥方法对沙棘提取物中活性成分含量的影响

来源:用户上传      作者:李治芳 温奎申 赵建军 雍婧姣 高晓娟 王汉卿 张霞

　　摘要 [目的]比较不同干燥方法对沙棘提取物水分及活性成分含量的影响，指导沙棘提取物生产实践。[方法]分别采用烘干法、紫外分光光度法、高效液相色谱法测定不同干燥方法沙棘提取物中水分、总黄酮、异鼠李素-3-O芸香糖苷含量。[结果]冷冻干燥提取物中水分含量最低，总黄酮和异鼠李素-3-O芸香糖苷含量最高。[结论]干燥方法对沙棘提取物的含水量、活性成分含量产生一定程度影响，该研究结果为沙棘提取物的进一步研究和利用提供了试验依据。
　　关键词沙棘提取物;干燥方法;水分;总黄酮;异鼠李素-3-O芸香糖苷;活性成分
　　中图分类号R282.4文献标识码A文章编号0517-6611（2020）04-0175-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.050
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Effects of Different Drying Methods on the Content of Active Ingredients in the Extracts of Hippophae rhamnoides L.
　　LI Zhi-fang1，2， WEN Kui-shen1，ZHAO Jian-jun1，2，3 et al
　　（1. Schoole of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan，Ningxia 750004;2. Ningxia Research Center of Modern Hui Medicine Engineering and Technology，Yinchuan， Ningxia 750004;3. Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization， Ministry of Education，Ningxia Medical University，Yinchuan， Ningxia 750004）
　　Abstract[Objective]To compare the content of water and bioactive component under different drying methods in the extracts of Hippophae rhamnoides.[Method]Using separately hot air drying method， UV， HPLC to determine the content of water， total flavonoids and isorhamL-3-o rutin by different drying methods of vacuum freeze drying， low-temperature oven drying and high-temperature oven drying in the extracts of Hippophae rhamnoides. [Result]The water content was the lowest，the contents of total flavonoids and isorhamnetin-3-O rutin were the highest in freeze-drying method than the other two.[Conclusion]The drying method has a certain effect on the water content and active ingredient content of Hippophae rhamnoides extract. The results of this study provide experimental basis for further research and utilization of Hippophae rhamnoides extract.
　　Key wordsExtracts of Hippophae rhamnoides L.;Drying methods;Water;Total flavonoids;Isorhamnetin-3-O rutin;Active ingredients
　　沙棘為胡颓子科植物沙棘（Hippophae rhamnoides L.）的干燥成熟果实，蒙古族、藏族习用药材，具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀的功效，用于治疗脾虚食少、食积腹痛、咳嗽痰多、胸痹心痛、瘀血经闭、跌扑瘀肿等症[1]，是国家卫健委公布的药食同源中药。沙棘富含多种化学成分，包括黄酮类、糖类、维生素类、甾醇类、类胡萝卜素类、挥发油类及微量元素等[2-4]。黄酮类化合物为其重要的活性物质，主要包括槲皮素、异鼠李素、杨梅素、山奈酚等黄酮苷元及其苷类，在治疗心脏疾病、高血压、高血脂、高血糖、肿瘤等方面具有良好的作用[5-7]。
　　中药提取物的干燥过程是其制备过程的重要环节，不同的干燥方法对提取物中指标成分有不同程度的影响[8-9]。笔者以沙棘总黄酮、异鼠李素-3-O芸香糖苷为指标成分，分析不同干燥方法对沙棘提取物中活性成分的影响，为优化沙棘提取物的干燥工艺提供试验依据，也为其进一步开发利用提供参考。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　1.1.1仪器。LC-20A高效液相色谱仪（岛津公司）;UV-2450紫外分光光度计（岛津公司）;EL 204电子分析天平（梅特勒-托利多）;Biosafer-12A 冷冻干燥机（赛飞（中国）有限公司）;WFO-700W送风式定温干燥箱（上海爱朗仪器（东京理化器械））;Wi17896超声波中药提取器（东西仪（北京）科技有限公司）;R-1050CE旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司） 　　1.1.2试材。沙棘，购自宁夏隆德县美隆饮料制品有限公司，经宁夏医科大学药学院王汉卿副教授鉴定为沙棘（Hippophae rhamnoides L.）的干燥成熟果实，按《中国药典》2015年版一部沙棘项下标准检测，结果符合规定。
　　1.1.3试剂。对照品芦丁（批号16111111，纯度98.0%），购自上海雅吉生物科技有限公司;对照品异鼠李素-3-O芸香糖苷（批号604-80-8，纯度98.0%），购自成都埃法生物科技有限公司;乙腈（色谱纯，Fisher公司）;高效液相分析用水为娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯。
　　1.2方法
　　1.2.1
　　提取物的制备。取5 kg沙棘干果，置超声波中药提取器中，加入30 L 60%乙醇（固液比1∶6），提取温度为60 ℃，超声提取3次，每次1 h，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.28～1.31的稠膏（80 ℃）。
　　1.2.2
　　干燥处理。将相同质量的沙棘提取物稠膏分别按不同的方法干燥，粉碎后过筛（过3号筛），进行测定。比较不同干燥方法对其含水量及活性成分含量的影响。
　　1.2.2.1
　　冷冻干燥。称取沙棘提取物稠膏200 g，在 -80 ℃ 预冻24 h，然后进行冷冻干燥。冻干条件：阱温度-40 ℃，真空度0.025 MPa，干燥时间48 h。
　　1.2.2.2
　　低温热风干燥。称取沙棘提取物稠膏200 g，平铺于白瓷盘中，鼓风干燥箱中干燥。干燥条件为60 ℃、36 h。
　　1.2.2.3
　　高温热风干燥。称取沙棘提取物稠膏200 g，平铺于白瓷盘中，鼓风干燥箱中干燥。干燥条件为80 ℃、18 h。
　　1.2.3
　　水分的测定。按照《中国药典》2015年版第四部0832水分测定法之烘干法（第二法）测定。分别精密称取不同方法干燥的干膏粉2 g，依法操作，每个样品平行测定3份。
　　1.2.4
　　总黄酮含量的测定。
　　1.2.4.1
　　对照品溶液的制备。精密称定芦丁对照品19.20 mg，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得每1 mL含芦丁0.384 mg的对照品溶液。
　　1.2.4.2
　　标准曲线的绘制。精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min。加氢氧化钠试液10 mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，按照紫外可见分光光度法，在500 mn的波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标、对照品溶液浓度（X）为横坐标绘制标准曲线。
　　1.2.4.3
　　供试品溶液的制备。取不同干燥方法制得的干浸膏粉约0.1 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液作为供试品溶液。
　　精密量取续滤液5 mL，置25 mL容量瓶中，加30%乙醇至6.0 mL，按照“1.2.4.2”方法，自“加5%亚硝酸钠溶液1 mL”起，依法测定吸光度，同时取供试品溶液5 mL，除不加氢氧化钠试液外，其余同“1.2.4.2”操作，得到的溶液作为空白，通过回归方程计算出供试品中总黄酮的量（以芦丁计）。
　　1.2.4.4
　　精密度試验。取同一对照品溶液，按照“1.2.4.1”方法显色后，测定吸光度6次，并计算RSD。
　　1.2.4.5
　　重复性试验。精密称取冷冻干燥的沙棘提取物干浸膏粉6份，各约0.1 g，按照“1.2.4.3”方法测定，并计算总黄酮含量的RSD。
　　1.2.4.6
　　稳定性试验。精密量取供试品溶液和对照品溶液各5 mL，按照“1.2.4.3”方法显色，放置15 min后，分别在30 min内每隔5 min在500 nm波长处测定，计算30 min内吸光度的RSD。
　　1.2.4.7
　　加样回收率试验。取冷冻干燥的沙棘提取物干浸膏粉6份，各约0.1 g，精密称定。精密称定芦丁对照品25.20 mg，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得每1 mL含芦丁2.52 mg的对照品溶液。分别精密量取对照品溶液1 mL，加入所称样品中，即各加入芦丁对照品2.52 mg，平行制备供试品溶液，按照“1.2.4.3”方法测定，计算回收率。
　　1.2.4.8不同干燥方法沙棘提取物中总黄酮含量。总黄酮含量按下式计算：
　　总黄酮含量（mg/g）=（Y+0.003）×25×250.011×m×5×1 000（1）
　　其中，Y为吸光度;m为称取的样品质量（g）。
　　1.2.5异鼠李素-3-O芸香糖苷含量的测定。
　　1.2.5.1
　　色谱条件。采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相A为乙腈，B为1%磷酸溶液，梯度洗脱：0～6 min，5%～15%A;6～15 min，15% ～20%A;15～20 min，20%～25%A;20～30 min，25%～40%A;30～35 min，40%～50%A;35～39 min，50%～70%A;39～39.5 min，70%～5%A;39.5～45.0 min，5%～5%A;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长380 nm，进样量20 μL。 　　1.2.5.2
　　对照品溶液的制备。精密称取异鼠李素-3-O芸香糖苷对照品14.10 mg，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得每1 mL含异鼠李素-3-O芸香糖苷0.282 mg的对照品溶液。
　　1.2.5.3
　　供试品溶液的制备。取不同干燥方法制得的干浸膏粉约0.2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
　　1.2.5.4
　　标准曲线的绘制。分别精密量取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的对照品溶液。在“1.2.5.1”色谱条件下进样测定，以对照品溶液浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归。
　　1.2.5.5
　　精密度试验。取同一对照品溶液，连续进样6次，测定异鼠李素-3-O芸香糖苷峰面积的RSD。
　　1.2.5.6
　　重复性试验。精密称取冷冻干燥的沙棘提取物干浸膏粉6份，按照“1.2.5.3”方法制备供试品溶液，进样测定，计算含量的RSD。
　　1.2.5.7
　　稳定性试验。取同一供试品溶液，室温下放置，分别在0、1、2、4、6、8 h测定峰面积，并计算峰面积的RSD。
　　1.2.5.8
　　加样回收率试验。取冷冻干燥的沙棘提取物干浸膏粉6份，各约0.2 g，精密称定。各加入异鼠李素-3-O芸香糖苷对照品1.15 mg，平行制备供试品溶液，按照“1.2.5.1”条件进行测定，计算回收率和RSD。
　　1.2.5.9不同干燥方法沙棘提取物中异鼠李素-3-O芸香糖苷含量。异鼠李素-3-O芸香糖苷含量按下式计算：
　　含量（mg/g）=（Y+83 081）×2559 085×m×1 000（2）
　　其中，Y为峰面积;m为称取的样品质量（g）。
　　2结果与分析
　　2.1不同干燥方法沙棘提取物水分含量
　　经分析，高温烘干沙棘提取物水分含量（2.8%）略低于低温烘干的（3.1%），而冷冻干燥沙棘提取物水分含量（1.0%）明显低于前二者。冷冻干燥是将含水物质先冻结成固态后，再使其中的水分升华成气态而除去水分的方法，干燥后的物质成多孔的海绵状，体积、性状基本不变，水分不会被包裹，因此能使水分除去更完全。
　　2.2不同干燥方法沙棘提取物中总黄酮含量
　　2.2.1
　　线性关系考察。以吸光度（Y）为纵坐标、对照品溶液浓度（X）为横坐标绘制标准曲线（图1），进行线性回归，得出回归方程为Y = 0.011 6X-0.003 8（R2= 0.999 7），表明总黄酮在7.68～76.80 μg/mL有良好的线性关系。
　　2.2.2精密度试验。按“1.2.4.4”方法操作，测定吸光度6次，RSD为0.25%，表明在此试验条件下精密度良好。
　　2.2.3重复性试验。按“1.2.4.5”方法操作，计算得总黄酮含量的RSD为1.7%，表明该方法重复性良好。
　　2.2.4
　　稳定性试验。按“1.2.4.6”方法操作，计算得出30 min内吸光度的RSD为0.86%（n=7），表明显色放置15 min 后的溶液在30 min内稳定。
　　2.2.5加样回收率试验。按“1.2.4.7”方法操作，计算得出回收率为93.1%，RSD 为2.4%，表明该方法准确、可靠，可用于沙棘提取物中总黄酮的含量测定。
　　2.2.6不同干燥方法沙棘提取物中总黄酮含量。试验结果表明，干燥方式影响沙棘提取物中总黄酮含量;干燥过程中温度越高，总黄酮损失越多。冷冻干燥提取物中总黄酮含量最高（47.35 mg/g），低温烘干的次之（29.04 mg/g），而高温烘干的最低（23.37 mg/g）。提取物热烘干过程中需要经过60 ℃或80 ℃的持续加热，可能会造成黄酮类成分损失。
　　2.3不同干燥方法沙棘提取物中异鼠李素-3-O芸香糖苷含量
　　2.3.1线性关系考察。以对照品溶液浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线（图2），进行线性回归，得出回归方程为Y =59 085X - 83 081（R2= 0.998 3），表明异鼠李素-3-O芸香糖苷在2.82～70.50 μg/mL有良好的线性关系。
　　2.3.2精密度试验。按“1.2.5.5”方法操作，测得异鼠李素-3-O芸香糖苷峰面积的RSD为0.42%（n = 6），表明在此试验条件下精密度良好。
　　2.3.3重复性试验。按“1.2.5.6”方法操作，计算得出异鼠李素-3-O芸香糖苷含量的RSD为2.0%（n = 6），表明该方法重复性良好。
　　2.3.4稳定性试验。按“1.2.5.7”方法操作，计算得出异鼠李素-3-O芸香糖苷峰面積的RSD为1.8%（n = 6），表明异鼠李素-3-O芸香糖苷在8 h内比较稳定。
　　2.3.5加样回收率试验。按“1.2.5.8”方法操作，计算得出回收率为93.1%，RSD 为3.2%，表明该方法准确、可靠，可用于沙棘提取物中异鼠李素-3-O芸香糖苷的含量测定。
　　2.3.6不同干燥方法沙棘提取物中异鼠李素-3-O芸香糖苷含量。试验结果表明，干燥方式对沙棘提取物中异鼠李素-3-O芸香糖苷含量略有影响。冷冻干燥中异鼠李素-3-O芸香糖苷含量最高（4.86 mg/g），低温烘干的次之（4.65 mg/g），而高温烘干的最低（4.41 mg/g）。 　　3讨论与结论
　　干燥是中药生产中的重要环节，中药在干燥过程中，除有物料间的混合和物理蒸发外，还有药物各成分间的相互作用，可能发生氧化、还原、聚合、水解、异构化等化学反应，从而引起物料物理稳定性、化学稳定性及生物稳定性的改变，进而对中药的内在质量与后续的临床疗效产生不同程度的影响[10]。
　　该试验以沙棘提取物中总黄酮及其主要黄酮苷类成分异鼠李素-3-O芸香糖苷为评价指标，分析不同干燥方法对沙棘提取物的影响，结果表明，冷冻干燥法所得沙棘提取物水分含量明显低于烘干法。原因可能是冷冻干燥过程中物质先冻结成固态后，其中的水分直接升华成气态而除去，干燥后的物质成多孔的海绵状，水分不会被包裹，能使水分除去更完全。物料含水量较低，不易返潮结块，有利于长期保存。
　　干燥温度对沙棘提取物中活性成分含量有显著影响，试验结果表明，冷冻干燥沙棘提取物中总黄酮含量远高于低温和高温烘干者。黄酮类物质含有大量酚羟基，容易被氧化，而冷冻干燥可以阻止氧化过程。冷冻干燥不经过加热过程，有利于保持提取物中的黄酮类成分。而低温烘干和高温烘干需经过60 ℃和80 ℃的加热过程，会造成黄酮类成分的损失。低温烘干提取物中总黄酮含量高于高温烘干者，试验也证实温度越高，黄酮类物质损失越多。由此可见，冷冻干燥对提取物中活性成分的保留具有明显优势。
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