不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞生物活性的影响

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　　[摘要]目的：观察不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUCMSCs）生物活性的影响。方法：分别用组织块贴壁法、酶消化法获取hUCMSCs，进行原代培养，记录各组首次传代时间，相差显微镜观察细胞的形态，流式细胞仪鉴定其CD29、CD44、HLA-ABC、CD34、CD45、HLA-DR抗原表达。分别用DMEM-LG、DMEM-HG和DMEM-F12 3种培养基培养第3代、第7代细胞，MTT法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况。结果：两种分离方法均能得到较均一的梭形或者多角形贴壁细胞，胞核大胞浆丰富，CD29、CD44、HLA-ABC抗原表达阳性，CD34、CD45、HLA-DR抗原表达阴性。用DMEM-F12培养的细胞活力更好，细胞生长更迅速。结论：两种分离方法均能得到hUCMSCs，DMEM-F12培养基更能够促进细胞的增殖，较适合于培养hUCMSCs。
　　[关键词]组织块贴壁法;酶消化法;人脐带间充质干细胞;培养基;生物活性
　　[中图分类号]Q813.1    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2020）02-0071-03
　　Abstract： Objective  To observe the effects of different separation methods and culture conditions on biological characteristics of hUCMSCs. Methods  The hUCMSCs were isolated form human umbilical cord by tissue adherence and digested with collagenase， the time of passage was recorded， in addition， the cell morphology was observed by phase contrast microscope， and the CD29、CD44、HLA-ABC、CD34、CD45、HLA-DR antigen expression was identified using flow cytometry. The 3rd and the 7th generation cells were cultured with DMEM-LG， MEM-HG， and DMEM-F12 culture medium. MTT was used to evaluate the growth of hUCMSCs. Phase contrast microscope was used to observe the morphological changes of aging cells. Results  hUCMSCs could be separated by each method. The adherent cells showed shuttle or multiple angle shapes， with rich cytoplasm， and positive for CD29、CD44、 HLA-ABC antigen， negative for CD34、CD45 and HLA-DR. DMEM-F12 could promote the proliferation of quiescent cells. And the cells presented the better viability. Conclusion  Both of the two methods can produce hUCMSCs， DMEM-F12 medium is more suitable for the culture of hUCMSCs.
　　Key words： tissue adherence method; collagenase digestion method; human umbilical cord-mesenchymal stem cells（hUCMSCs）; culture medium; biological characteristics
　　目前较常用的人脐带间充質干细胞（Human umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUCMSCs）分离方法有组织块贴壁法、酶消化法、流式细胞仪法、免疫磁珠法等，由于流式细胞仪法和免疫磁珠法对操作技术要求高，难免对细胞造成化学或机械损伤，影响细胞生物学特性，所以很少应用。最常用者为前两种方法。不同的培养基对细胞的生长情况也有影响，目前常用的培养基有DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-F12等。本实验将通过对照观察两种不同分离培养方法和三种不同培养基培养条件下的hUCMSCs的生物学活性，以期找到较适宜的hUCMSCs的培养方法和培养条件。
　　1  材料和方法
　　1.1 材料：健康产妇新鲜脐带（解放军联勤保障部队第940医院妇产科提供，产妇及家属授权同意），DMEM-HG培养基、DMEM-LG培养基、DMEM-F12培养基（GIBCO公司，美国），胎牛血清（GIBCO公司，美国），胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶（Sigma公司，美国）、MTT（Amresco公司，美国）、DMSO（Amresco公司，美国）
　　1.2 方法
　　1.2.1 人脐带间充质干细胞的培养
　　1.2.1.1 组织块贴壁法：取新生儿脐带置无菌生理盐水，PBS充分洗涤至无血迹， 将其剪碎至碎泥状后转入培养皿，加入含10% FBS的DMEM-F12培养液，置于37℃、5%CO2培养箱培养。7d后，剔除组织块首次换液。以后每2d换液1次，至贴壁细胞80%融合后传代。 　　1.2.1.2 胶原酶消化法：开始同组织块贴壁法，脐带剪碎至碎泥状转移至1g/L胶原酶Ⅱ中，37℃恒温振荡仪持续消化30min后，随即用1g/L胰酶37℃恒温振荡仪持续消化30min。以细胞筛过滤消化液，滤液1 500r/min离心10min，弃上清液以PBS洗2次。按照1.0×106/cm2的密度均匀接种于含DMEM-F12培养液（含10% FBS）的培养皿中。3d后首次换液，去掉未贴壁细胞。以后每2d换液1次，至贴壁细胞80%融合后传代。
　　1.2.2 细胞消化传代：弃去培养基，10% PBS冲洗3遍，加入胰蛋白酶（2.5g/L）和EDTA（0.2g/L）混合液（1：1）消化后可见细胞收缩变圆，即将脱离皿壁时弃消化酶，加2倍体积10% PBS终止消化，反复吹打混匀，1 000r/min离心10min弃上清液，加入新鲜培养基，以1：3～1：4比例细胞传代，记P1，传至P3代后， 细胞形态较为单一稳定。每日用倒置相差显微镜观察细胞的活力和生长情况，并适时照相。
　　1.2.3 流式细胞仪鉴定：取P3、P5、P7代hUCMSCs，弃培养基，1：1的2.5g/L胰蛋白酶（2.5g/L）和EDTA（0.2g/L）混合液（1：1）消化，以10% PBS洗涤3遍，制成浓度为3×105的单细胞悬液，每个Eppendof管加100μl细胞悬液，共6管。分别加入抗人CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PerCP、HLA-DR-FITC，HLA-ABC-FITC各10μl，室温孵育30min，流式细胞仪检测。
　　1.2.4 不同培养基对细胞的影响：以MTT法和计数板法检测不同培养基对细胞增殖情况的影响：取第3代形态均一的细胞分别以DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-F12配置成密度为1×108/L的细胞悬液，以每孔0.2ml向96孔板接种，细胞处理组每板接种30个孔，2d换液，前9d每日每组取3个孔加入20μl MTT常温孵育5h，弃去培养基加100μl二甲基亚砜常温振荡10min，酶标仪检测吸光度值（492nm波长）;部分细胞分别以3×104/孔接种到24孔板中，每天各取3孔消化计数细胞。连续观察9d，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线。
　　1.2.5 观察指标：MTT法和计数板计数法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况。
　　1.2.6 统计学分析：采用SPSS 17.0软件进行统计处理，以（x?±s）表示计量资料，运用单因素方差分析进行3组间比较，P<0.05为差异有显著性意义。
　　2  结果
　　2.1 不同分离方法的影响：用组织块贴壁法分离培养hUCMSCs，7d左右可见散在的长条状细胞（见图1A）。弃组织块，更换培养液，可见多个贴壁生长细胞集落。每个集落细胞数数量不等，形态与骨髓间充质极为相似，大为多角形或扁平状的成纤维样细胞。细胞透光度好，核仁明显，胞体与骨髓MSC无明显差异。1周后，每个细胞集落细胞数可达数百个，细胞形态大多渐变均一的纺锤形。2周左右90%细胞发生融合。此时以胰酶消化，按1：3的比例传代，传代后的细胞增殖迅猛，约每2d即可达到90%以上融合，需多次传代或冻存。
　　用胶原酶消化法分离hUCMSC，第2天即看见有散在的条索状贴壁细胞（见图1B）。1周左右时，成纤维样细胞贴壁并形成集落，偶见少量异常细胞集落，呈卵石样，或为内皮细胞集落。成纤维样细胞增殖能力强大，至2周左右可达到90%细胞发生融合。多次传代后可得到形态均一稳定的成纤维样细胞（见图2）。传代后的细胞形态无明显变化，性质稳定，但多次传代后细胞渐老化。
　　镜下观察发现传代培养2～3d后细胞进入对数增长期。两组细胞均生长旺盛，首次传代时间平均为3～5d，传代时间比较差异无显著性意义（F=31.5，P>0.05）。两种方法分离培养的细胞经过传代后均生长较好，两组细胞生长活性比较差异无统计学意义（P>0.05）。
　　
　　2.2 细胞鉴定：用倒置相差显微镜可以观察到较均一的长梭形或扁平形的成纤维样细胞，折光度好，核仁明显。随着细胞迅速扩增，细胞集落呈现出典型的漩涡状（见图2）。经过2传代，均可得到形态均一的细胞。流式鉴定其阳性表达CD29、CD44、HLA-ABC，阴性表达CD34、CD45、HLA-DR，证明是hUCMSCs。
　　2.3 不同培养基对生长的影响：分别以DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-F12 3种培养基培养第3代的hUCMSCs后，MTT法检测发现较DMEM-LG和DMEM-HG而言，DMEM-F12组的A492nm明显较高（见表1）。计数板法观察到DMEM-F12组细胞提前发生倍增，细胞总量也最多（见图3）。
　　3  讨论
　　2000年，Rrices[1]首次报道从脐带血中可以分离培养出一种能够分化为脂肪细胞和成骨细胞的多能干细胞，后来证实为hUCMSCs，随后Mitchell等[2]研究发现，脐带华尔通氏胶的基质细胞在体外培养能增殖80倍以上，能表达干细胞的标记包括c2kit（CD117）和端粒酶。提示可能有间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）存在于脐带中，随后有多位学者分别从脐静脉内皮和内皮下、脐带Wharton’s胶质和血管周围组织中分离培养出了hUCMSCs，并初步建立了脐带间充质干细胞的分离培养方法[3-5]。
　　各个实验室采用多种方法进行hUCMSCs的分离培养，许多研究人员尝试通过改变培养条件和改变培养基成分对间充质干细胞的扩增进行探索[6]，目前用于hUCMSCs的组织培养主要是脐带华通胶和脐静脉[7-8]，获取方法主要有酶消化法[9]、组织块法等。尽管组織块法获取细胞耗时过长，但这种方法获得的细胞纯度更高、且增殖率较高[10]。而且酶消化法耗材昂贵、操作技术要求高，耗时较长，难免对细胞造成化学和机械损伤。Iftimia-Mander等[11]研究亦表明酶消化脐带分离出的MSCs，其细胞活性较组织块法低。与此相比，组织块法则简捷，经济，能够更好地维持细胞活力并减少损伤机会，培养体系中避免了血细胞、血管内皮细胞或其他细胞的干扰。本实验采用组织块贴壁法与酶消化法分别成功获得贴壁生长的hUCMSCs并形成集落和传代扩增，且传代后的细胞在数量与生长活性方面无明显差异。 　　Romanov等[9]认为胎儿血液循环中富含hUCMSCs，并且随着胎儿的成熟，大部分hUCMSCs定位于脐静脉内皮下层和胎盘。这就部分解释了脐带富含MSCs的原因。本实验研究发现，选择培养足月产胎儿脐带所hUCMSCs较多，这与Romanov的观点相符合;在脐带分离培养过程中注意无菌操作，在分离华通胶时剔除动静脉血管以免内皮细胞混入;分离出的华通胶不必再经过消毒剂浸泡，因为可能会对hUCMSCs活性有影响。
　　hUCMSCs相对于其他细胞更脆弱，对环境敏感性更强，生长环境微弱的变化或许就会影响它的生长，因此必须选择适宜的培养基。常用的培养有DMEM-LG，DMEM-HG，DMEM-F12 3种。文献报道中常用DMEM-LG，但是细胞的首次传代时间长，需要14d左右[12]，传代细胞的生长周期也较长。但是本实验发现DMEM-F12培养的hUCMSCs生长旺盛，细胞形态均一稳定，原代培养时间短（约10d），并且能保持hUCMSCs长期处于未分化状态，这也许是因为与前两者相比DMEM-F12含有较丰富的营养物质和微量元素。
　　总之，应用组织块贴壁法与酶消化法都能够得到纯度较高的hUCMSCs，且不影响其生物学活性，但组织块贴壁法操作更为简捷、效率更高，是适宜的hUCMSCs分离方法。同时，DMEM-F12培养基可能较DMEM-LG、DMEM-HG培养基更适合于hUCMSCs的培养。
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2019-07-18
　　本文引用格式：徐斌，刘毅.不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞生物活性的影响[J].中国美容医学，2020，29（2）：71-74.
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