燕麦成熟胚愈伤组织诱导的优化

来源:用户上传      作者:田娟 孙墨可 董玉迪 郭来春 王春龙 张曼

　　摘要： 研究了冷处理、基因型、消毒方法和不同培养基等对燕麦成熟胚愈伤组织诱导的影响。试验结果表明，在种子消毒前，4 ℃冰箱冷处理3 d最为合适;在进行种子消毒时先用75%乙醇处理10 min，无菌水冲洗5 min，再用10%次氯酸钠（NaClO，有效氯浓度≥10%）处理15 min，无菌水冲洗5 min的方法;在配制诱导培养基时，应选择W14为基本培养基，添加2 mg/L 2，4-D、1 mg/L NAA、500 mg/L水解酪蛋白（CH）、30 g/L蔗糖、6 g/L植物凝胶，这样才会得到更高的出愈率。在愈伤组织分化时，6-BA的质量浓度为0.5 mg/L最佳。
　　关键词： 燕麦;成熟胚;愈伤组织;诱导;2，4-D;6-BA;水解酪蛋白
　　中图分类号： S512.604.3  文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）05-0057-04
　　燕麦（Avena sativa L.），又名莜麦、雀麦、野麦子等，属禾本科（Gramineae）燕麦属（Avena L.），一年生草本植物[1]，是一种集饲用、营养、药用于一身的特色杂粮作物，对畜牧业发展和生态建设都具有重要意义[2-3]。国内在燕麦方面的研究主要集中在品种选育[4-5]、栽培技术[6-8]等。随着生物技术的发展，对改良植物品质、增强植物抗性等方面，利用植物基因工程是一项行之有效的方法，进行转基因育种的前提是建立高效稳定的组织培养再生体系[9]。在燕麦方面，已有不少学者以花药[10]、颖片[11]、幼穂[12]、幼胚[13]、成熟胚[14-15]为材料建立了燕麦再生体系，成熟胚与其他材料相比，材料丰富，保存期长，易于获取，且不受植株发育时期和季节等因素的限制，具备取材方便、操作简单等优点，是进行燕麦基因转化的良好受体。为此，本试验以燕麦成熟胚为试验材料，通过对不同消毒方法、不同基因型、不同基本培养基、不同2，4-D浓度及冷处理等方面的研究，探索影响燕麦成熟胚愈伤组织诱导的因素，筛选适宜于燕麦成熟胚培养的培养基，旨在提高愈伤组织分化和再生能力。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　供试品种为吉林省白城市农业科学院选育的白燕11号（B11）和从加拿大引进的燕麦品种JA3。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 不同燕麦种子消毒方法消毒效果的比较
　　选取成熟籽粒饱满的燕麦JA3种子，用自来水冲洗0.5 h，在超净工作台内，先用75%乙醇处理3～15 min，无菌水冲洗5 min，再用10%次氯酸钠（NaClO，有效氯浓度≥10%）处理10～30 min，无菌水冲洗 5 min。放入25 ℃恒温培养箱中黑暗培养，接种后的第15天调查记录污染数和出愈情况。培养基为MS+4 mg/L 2，4-D+1 mg/L NAA+30 g/L蔗 糖+6 g/L植物凝胶，pH值为5.8。
　　1.2.2 不同培养基对愈伤组织诱导的影响
　　选用不同基因型JA3和B11的成熟胚，将燕麦种子置于4 ℃冰箱中3 d后用处理5（表1）消毒，分别接种到不同的培养基上：不同组合（表2）+30 g/L蔗糖+6 g/L 植物凝胶+500 mg/L水解酪蛋白（CH），pH值为5.8。放入25 ℃恒温培养箱中黑暗培养15 d后，记录出现的愈伤组织数。计算其出愈率，选择最适的诱导培养基，分析不同基因型、不同基本培养基、不同2，4-D浓度对燕麦成熟胚愈伤组织诱导的影响。
　　1.2.3 水解酪蛋白
　　以JA3为试验对象，在诱导处理1培养基中添加500 mg/L水解酪蛋白（CH），以诱导处理1培养基作对照，15 d后观察记录愈伤组织的出愈率。
　　1.2.4 低温处理
　　以JA3为试验对象，将燕麦种子置于4 ℃冰箱中处理1、2、3、4 d，室温下未处理的种子作为对照，處理5消毒后接种在组合7培养基，培养条件均放入25 ℃恒温培养箱中黑暗培养。15 d后观察记录愈伤组织的出愈率。
　　1.2.5 愈伤组织分化培养基的选择
　　有文献记载6-BA对愈伤组织分化影响最大[16]，为系统地探讨6-BA对愈伤组织分化的影响，以W14为基本培养基附加不同质量浓度的6-BA（分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和30 g/L蔗糖+6 g/L植物凝胶+500 mg/L水解酪蛋白（CH）+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT，pH值为5.8。置于（25±1） ℃下光照培养，光照度为1 500～2 000 lx，光周期16 h/d，接种后12 d统计分化率。
　　1.2.6 数据统计分析
　　试验数据用Excel和SPSS统计软件进行分析。
　　污染率=污染种子数/接种种子总数×100%;
　　 出愈率=出现愈伤组织外植体数/接种外植体总数×100%;
　　 分化率=出现苗的愈伤组织数/转移的愈伤组织总数×100%。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同消毒处理比较
　　由表1可知，所有的处理组合都没有污染，都可以有效消毒，但是不同处理JA3的出愈率有所不同，可能是乙醇或者次氯酸钠的消毒时间过长对外植体造成损伤影响出愈情况。处理5的出愈率最高，达到62.50%，处理4的出愈率最低，仅 16.67%。在乙醇处理时间相同的情况下，次氯酸钠消毒时间越长，出愈率越低，对外植体的损伤越严重。
　　2.2 不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响
　　在植物组织培养中，愈伤组织的产生是整个组织培养的基础，培养基是最为关键的影响因素。统计2种培养基的出愈率情况（表2）可以看出，在其他条件都相同的情况下，基本培养基W14要比基本培养基MS出愈率更高。由表3可以看出，培养基对愈伤组织出愈率的影响极显著（P=0.002<0.01）。 　　2.3 不同基因型对愈伤诱导的影响
　　由表2可以看出，不同燕麦基因型成熟胚的最佳诱导培养基不同。JA3的最适愈伤组织诱导培养基组合为W14+3 mg/L 2，4-D+1 mg/L NAA，B11的最适愈伤组织诱导培养基组合为W14+2 mg/L 2，4-D+1 mg/L NAA。由表3可以看出，基因型对出愈率的影响达到了极显著水平（P<0.01）。
　　2.4 不同质量浓度2，4-D对愈伤组织诱导的影响
　　由表2、表3可以看出，2，4-D质量浓度对出愈率的影响极显著。2种基本培养基中都是随着2，4-D质量浓度增加出愈率先升高后降低，在2 mg/L时出愈率最高，在MS中平均出愈率达到73.08%，在W14中平均出愈率达到88.23%。不同基因型
　　2，4-D的最适质量浓度不同，JA3的最适质量浓度为3 mg/L，B11的最适质量浓度为2 mg/L。
　　2.5 水解酪蛋白
　　由图1可以看出，添加500 mg/L水解酪蛋白处理下JA3的出愈率为81.16%，不添加水解酪蛋白处理下JA3的出愈率为62.50%，这表明水解酪蛋白在燕麦成熟胚愈伤组织诱导中可以提高其出愈率。
　　2.6 低温处理
　　由图2可以看出，对照组中JA3出愈率為 81.16%，随着处理天数的增加出愈率明显增加，当冷处理3 d时出愈率达到最高水平（96.70%），这表明适当的低温处理（4 ℃处理3 d）在燕麦成熟胚愈伤组织诱导中可以提高其出愈率。
　　2.7 不同质量浓度6-BA对愈伤组织分化的影响
　　在不同质量浓度6-BA的培养基中愈伤组织分化结果如表4所示，随着质量浓度增加，分化率降低。分化率最高的质量浓度为0.5 mg/L，平均分化率为41.38%;1 mg/L中的平均分化率为34.41%;1.5 mg/L中的平均分化率为33.72%;2 mg/L中的平均分化率为30.56%。其中，在相同质量浓度 6-BA 的培养基中，B11的分化率要比JA3的分化率高，说明B11的分化能力比较强。本研究中的分化率不高，没有达到50%，除了与基因型和培养基有关外，可能与愈伤组织的质量有关，在诱导出愈伤组织后可以转移到继代培养基中进行继代培养，改善愈伤组织后再进行分化。
　　3 讨论与结论
　　低温具有增加核酸含量、诱导其蛋白质合成的效应[16]，还能改善幼穗及花药的出愈状态[17]。本试验表明，适当的低温处理（4 ℃处理3 d）在燕麦成熟胚愈伤组织诱导中可以提高其出愈率。
　　种子表面灭菌处理可以创造一个无菌环境，有利于愈伤组织的形成。在燕麦愈伤组织诱导中常用的消毒剂有氯化汞、乙醇和次氯酸钠。消毒剂的选择和处理时间长短对试验能否成功非常关键。李建民等采用的是乙醇和氯化汞相结合的消毒方法[18-20]，可以有效消毒，但是氯化汞有剧毒，容易对身体造成伤害，也容易对环境造成污染。罗志娜等选用不同浓度乙醇和次氯酸钠相结合的消毒方法也可以有效消毒[21-22]。本研究选用对人和环境友好的乙醇和次氯酸钠，选出了最佳的消毒组合：先用75%乙醇处理10 min，无菌水冲洗5 min，再用10%次氯酸钠（NaClO，有效氯浓度≥10%）处理 15 min，无菌水冲洗5 min，不仅能够有效地消毒，而且不会对外植体造成损伤影响出愈情况。
　　 常用的基本培养基有多种，胡晓旭比较了基本培养基MS和N6，结果表明，在2种不同的基础培养基上进行愈伤组织的诱导差异显著，MS上愈伤组织的出愈率和成活率明显高于N6培养基[23];李建民等在MS、B5、N6、改良N6（N6培养基中的盐酸硫胺改为0.4 mg/L，肌醇与MS同量）4种培养基上诱导愈伤组织，结果发现在4种培养基上种子胚均被诱导形成了愈伤组织，诱导率最高的为改良N6培养基[18]。本研究对比了W14和MS这2种基本培养基，结果显示，在其他条件都相同的情况下，基本培养基W14要比MS出愈率高，并且基本培养基对愈伤组织出愈率的影响极显著。
　　在禾本科植物愈伤组织诱导中，2，4-D通常是起决定作用的植物生长调节物质[24-25]。Hassan等通过研究认为，2，4-D与愈伤的形成相关，能促进愈伤的生长[26]。Kim等研究得出只有适量浓度的2，4-D才会增加外植体的出愈率，使用过量或低浓度少量使用都不利于愈伤组织的形成[27]。本试验用JA3和B11成熟胚为材料，2种基本培养基中添加2 mg/L 2，4-D时出愈率最高，在MS中平均出愈率达73.08%，在W14中平均出愈率达到88.23%，明显高于其他质量浓度，所以添加2 mg/L 2，4-D 为最佳质量浓度;但是不同基因型的最适 2，4-D 质量浓度不同，JA3的最适质量浓度为 3 mg/L，B11的最适质量浓度为2 mg/L，这与罗志娜等的结论[21]一致。所以在诱导燕麦成熟胚愈伤组织时，2，4-D的质量浓度要根据基因型不同适量选择，建议质量浓度为2～3 mg/L。
　　有研究表明，水解酪蛋白（CH）可以提高燕麦愈伤组织诱导率、改善愈伤组织的质量和提高再生率[22，28]。本试验中发现，500 mg/L CH有助于提高燕麦愈伤组织的出愈率。
　　在植物组织培养中，6-BA的主要功能是促进细胞的分裂和芽的形成，其活性较强，对于产生花粉胚状体有明显的提高作用，而对于分化成苗 6-BA 可以起到主导作用。本研究设置了0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L这4个不同质量浓度的6-BA，试验结果表明，随着质量浓度增加，分化率降低，在愈伤分化时，0.5 mg/L 6-BA为最佳质量浓度。
　　综上所述，在进行燕麦愈伤组织诱导时，种子消毒前于4 ℃冰箱冷处理3 d最为合适;在进行种子消毒时先用75%乙醇处理10 min，无菌水冲洗 5 min，再用10%次氯酸钠（NaClO，有效氯浓度≥10%）处理 15 min，无菌水冲洗5 min的方法;在配制诱导培养基时，应选择W14为基本培养基，添加2 mg/L 2，4-D、1 mg/L NAA、500 mg/L水解酪蛋白（CH），这样才会得到更高的出愈率;在愈伤分化时，6-BA的质量浓度为0.5 mg/L最佳。 　　参考文献：[HJ1.7mm]
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　　收 稿日期：2019-01-24
　　基金项目：国家燕麦荞麦产业技术体系建设专项（编号：CARS-08）。
　　作者简介：田 娟（1985—），女，吉林松原人，硕士，研究实习员，主要从事生物技术育种。E-mail：tianjuanyes@126.com。
　　通信作者：张 曼，助理研究员，主要从事生物技术育种。E-mail：ashuan19870324@126.com
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