不同干燥方法对巴戟天寡糖化学成分的影响

来源:用户上传      作者:孙恬 刘凤松 冯冲

　　摘要：考察不同干燥方法（烘干、微波、真空干燥、阴干、晒干）对巴戟天药材中寡糖类成分含量的影响。利用HPLC-ELSD法测定储存过程中D-果糖、D（+）-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量。色谱柱为Waters XBridgeTM Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm），流動相为0.2%三乙胺乙腈-0.2%三乙胺水溶液，梯度洗脱，体积流量0.8 mL/min，柱温35 ℃;ELSD漂移管温度75 ℃，氮气流量2.5 L/min。结果表明，在不同温度（45、60、75、90 ℃）烘干过程中，随着温度的升高，耐斯糖和1F-果呋喃糖基耐斯糖含量呈逐渐降低的趋势，其中以60 ℃耐斯糖含量较高;其他干燥方法中，微波和真空干燥方法耐斯糖含量均降低，且成本较高，建议不采用;晒干和阴干虽成本低，但由于干燥过程的时间较长，耐斯糖在干燥过程中会降解，含量明显下降。因此，建议巴戟天药材采用低温鼓风烘干，最佳适宜温度为60 ℃。
　　 关键词：巴戟天;寡糖;干燥方法;化学成分;色谱分析
　　 中图分类号： R284.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）06-0180-04
　　 巴戟天药材来源于茜草科植物巴戟天（Morinda officinalis How）的干燥根，具有补肾阳、祛风湿、强筋骨的功效[1]。巴戟天为广东省道地药材，也是我国著名的“四大南药”之一，作为滋补肾阳的重要中药材，在我国具有悠久的应用历史。现代的研究表明，巴戟天中主要含有寡糖、蒽醌、环烯醚萜等成分[2]，其中主要有效成分为寡糖类化合物，占生药材的30%以上[3]，具有多方面的药理作用，包括抗抑郁、改善生殖功能、神经保护等[4-7]。巴戟天为多年生植物，采收后产地加工主要为晒干或阴干，这些方法虽然成本低，但都存在干燥周期较长、易受天气条件影响、干燥后药材质量不均匀等问题。巴戟天中的寡糖为菊淀粉型（inulin），其结构为若干个果糖单元以β-（2→1）-键连接，末端连接蔗糖残基[8]。前期研究表明，巴戟天寡糖在提取加热过程中存在化学不稳定性[9]，在干燥过程中寡糖是否发生变化，尚未见报道。因此，本研究对不同干燥方法（烘干、微波、真空干燥、阴干、晒干）对巴戟天寡糖化学成分的影响进行研究，为巴戟天初加工标准的制定和规范化研究提供科学依据。
　　1 仪器与试剂
　　1.1 仪器
　　 HITACHI Primaide高效液相色谱仪[日立（中国）有限公司生产]，UM5800蒸发光散射检测器（上海通微分析技术有限公司生产），SHIMADZU UX420H电子天平（精度=0.01 g，日本SHIMADZU公司生产），Sartorius电子分析天平（精度=0.1 mg，瑞士Sartorius公司生产），DFT-200高速万能粉碎机（25 000 r/min，温岭市林大机械有限公司生产），CQ-200超声波清洗器（功率200 W，频率40 kHz，上海音波声电科技公司生产），LD4-2A低速离心机（转速3 000 r/min，北京医用离心机厂生产）。
　　1.2 试剂
　　 乙腈（色谱纯，美国ACS化学试剂公司生产），三乙胺（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司生产），乙醇为分析纯，水为去离子水。
　　 对照品：D-果糖（D-fructose，批号：J31M8R36916）、D（+）-无水葡萄糖[D（+）-glucose，批号：S08G6J1]、蔗糖（sucrose，批号：S02S6G1）、1-蔗果三糖（1-kestose，批号：C09D8Q50061）、耐斯糖（nystose，批号：Z17A9H59088）、1F-果呋喃糖基耐斯糖（1F-fructofuranosylnystose，批号：S09A8D41431）均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98%。
　　 样品：巴戟天药材来源于广东省德庆县高良镇，种植4年，经广州中医药大学丁平研究员鉴定为巴戟天（Morinda officinalis How）的干燥根，凭证标本存放于广州中医药大学中药资源教研室。将巴戟天生品分别用45、60、75、90 ℃烘干（鼓风干燥）以及微波干燥、真空干燥、阴干、晒干的方法进行干燥，打粉（65目），供含量测定。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件及系统适用性考察
　　 色谱柱为Waters XBridgeTM Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm），流动相为0.2%三乙胺乙腈 （A）-0.2%三乙胺水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，75%～70% A;10～20 min，70% A;20～45 min，70%～60% A;45～60 min，60% A;60～63 min，60%～75% A;63～75 min，75% A）;体积流量0.8 mL/min;进样量：20 μL;柱温：35 ℃;蒸发光散射检测器（ELSD）漂移管温度：75 ℃;氮气流量：2.5 L/min。在此条件下，主峰保留时间适中，各色谱峰理论塔板数均不小于9 000，D-果糖、D（+）-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，符合《中国药典》的要求。空白溶液、混合对照品、巴戟天寡糖供试品溶液HPLC-ELSD图见图1。
　　2.2 对照品溶液的制备
　　 精确称取对照品D-果糖、D（+）-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖适量，置于10 mL量瓶中，加入体积分数为60%的乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含 D- 果糖1.378 mg、D（+）-无水葡萄糖 0.828 mg、蔗糖1.210 mg、1-蔗果三糖0.832 mg、耐斯糖1.280 mg、1F-果呋喃糖基耐斯糖1.658 mg的混合对照品储备液。 　　2.3 供试品溶液的制备
　　 称取巴戟天粉末（过6号筛）0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入体积分数为50%的乙醇50 mL，称质量，静置30 min，流水超声处理20 min，擦干，称质量，用50%乙醇补足损失质量，摇匀，于2 000 r/min离心10 min，上清液以0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
　　2.4 方法学考察
　　2.4.1 线性关系考察 分别精确吸取混合对照品贮备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于1 mL量瓶中，加入体积分数为50%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得不同浓度的混合对照品溶液。分别按“2.1”项色谱条件进样，每个样品平行测定3次，取峰面积平均值，以各混合对照品进样质量（μg）的对数值x为横坐标，以峰面积积分值的对数值y为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程、线性范围及相关系数见表1，结果表明，耐斯糖等6种寡糖在相应的线性范围内均呈良好的线性关系。
　　2.4.2 精密度试验 日内精密度：取巴戟天，按照“2.3”节方法制备供试品溶液，于同一日内连续进样6次，计算D-果糖、D（+）-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的峰面积，上述6种成分峰面积的相对标准偏差RSD范围在1.91%～4.73%。日间精密度：精确吸取同一供试品溶液，分别于3日内每日连续进样3次，计算D-果糖、D（+）-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F- 果呋喃糖基耐斯糖的峰面积，上述6种成分峰面积的RSD范围在2.29%～3.90%。结果表明，仪器精密度良好。
　　2.4.3 稳定性试验 取巴戟天，按照“2.3”节方法制备供试品溶液，在供试品溶液制备后0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、24.0、48.0、72.0 h分别进样 20 μL，计算D-果糖、D（+）-无水葡萄糖、蔗糖、1- 蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的峰面积，上述6种成分峰面积的RSD范围在1.77%～3.51%。结果表明，供试品溶液中的D-果糖等6种成分在72 h内稳定。
　　2.4.4 重复性试验 精确称取同一批巴戟天6份，每份2.0 g，按照“2.3”节供试品溶液制备方法，平行制备6份供试品，进样，计算D-果糖、D（+）-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F- 果呋喃糖基耐斯糖的峰面积，并计算各成分的含量。上述6种成分含量RSD范围在2.20%～2.68%。结果表明，该方法重复性良好。
　　2.4.5 加样回收率试验 精确称取已知含量的巴戟天9份，每份1.0 g，分别加入每1 mL含D-果糖4.080 mg、D（+）-无水葡萄糖1.880 mg、蔗糖3980 mg、1-蔗果三糖2.520 mg、耐斯糖 6.220 mg、1F-果呋喃糖基耐斯糖7.650 mg的混合对照品溶液1、2、3 mL（各3份），按照“2.3”节方法平行制备供试品溶液，测得D-果糖、D（+）-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的平均回收率（n=9）分别为97.28%、97.90%、101.00%、101.69%、99.79%、101.29%，RSD分别为2.25%、2.08%、2.01%、1.92%、2.36%、178%，表明该方法的准确度较好。
　　2.5 不同干燥方法巴戟天寡糖含量测定
　　 按“2.3”节方法制备供试品溶液，按“2.1”节色谱条件进样测定，计算巴戟天不同等级各样品中D-果糖、D（+）-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量（按干燥品计算），结果见表2。
　　 从表2中可以看到，每一种干燥方法对巴戟天中的寡糖含量均有影响，综合考虑操作简易度、所耗时长与成本以及最终的寡糖含量，可得出60 ℃烘干条件较适合在企业生产中推广，微波干燥次之，然后为晒干干燥、真空干燥、阴干干燥等。
　　3 讨论
　　 巴戟天中的寡糖类成分没有紫外吸收，不适宜用传统的紫外检测器进行定性定量分析，而蒸发光散射检测器（ELSD）可以弥补这方面的不足。本试验考察了Waters XBridgeTM Amide、Thermo APS-2 HYPERSIL、Ecosil 120-5 Amino等色谱柱的分离效果，其中Waters XBridgeTM Amide色谱柱对D-果糖等6种待测成分的分离效果最好，各成分保留时间适中，基线平，噪音低，故选择该色谱柱进行含量测定。另外考察了乙腈-水和含不同浓度三乙胺的乙腈-水溶液作为流动相的分离效果，结果表明，在乙腈和水中加入等量的三乙胺（0.2%）时，各成分的分离效果最好，且有利于有机相和水相的均匀混合及系统pH值的稳定。
　　 在不同温度（45、60、75、90 ℃）烘干过程中，随着温度的升高，耐斯糖和1F-果呋喃糖基耐斯糖呈逐渐降低的趋势，其中以60 ℃烘干过程中耐斯糖含量最高。其他干燥方法中，微波和真空干燥方法耐斯糖含量均降低，且成本较高，建议不采用;晒干和阴干虽成本低，但由于干燥的过程时间较长，耐斯糖在干燥过程中会降解[9]，含量明显下降，不宜采用。因此，建议巴戟天药材采用低温60 ℃鼓风烘干。
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