黄腐酸钾与壳寡糖结合拮抗菌XW5抑制苹果腐烂病初步探索

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　　摘 要：通过土壤稀释法筛选出对苹果腐烂病有拮抗作用的放线菌，采用平板对峙法测定拮抗菌的抑菌活性;测定黄腐酸钾和壳寡糖单因素对苹果腐烂病的抑制作用;正交实验测定放线菌、黄腐酸钾、壳寡糖复合后对苹果腐烂病的抑制作用。结果显示：筛选得到的菌株Z-10为放线菌，对苹果腐烂病致病菌的抑制效果良好，抑菌率达到50.41%;黄腐酸钾浓度为0.3%时，抑菌率达到85.88%;壳寡糖浓度为0.1%时，表现出较强的抑菌效果，抑菌率达到61.25%。黄腐酸钾、壳寡糖、放线菌稀释菌液浓度分别为0.3%、0.1%、1.25×10-3mg/mL时，对苹果腐烂病的抑制率达到77.85%。
　　关键词：苹果腐烂病;放线菌;黄腐酸钾;壳寡糖;配方
　　中图分类号：S-3       文献标识码：A
　　DOI：10.19754/j.nyyjs.20200515006
　　 苹果腐烂病，是黑腐皮壳属（Valsa ceratosperma，无性型为壳囊孢属Cytospora）真菌侵染树体而引起的一种病害，又称臭皮病、烂皮病[1]。患病较轻的苹果树会削弱树势，降低苹果产量，严重的病树会导致枯死，毁园。苹果腐烂病在我国北部地区发生广泛，已经成为危害我国苹果产业的重要病害之一。
　　目前，防治苹果腐烂病的方式主要还是化学防治，但是长期使用化学制剂会使病原菌产生一定的抗药性，环境污染和化学残留问题也随之而来。探索生物防治技術已经成为生产上亟待解决的重要课题[2]。微生物防治，是利用有益微生物和微生物代谢产物对病害进行防治，利用2个生物间进行营养和空间的竞争，是一种有效的防治技术。徐路明等人[3]从土壤中分离的放线菌X1菌株能广谱抑菌，其发酵液能很好地抑制苹果腐烂病、苹果轮纹病和黄瓜枯萎病等多种病菌。薛应钰等人[4]用分离到放线菌菌株ZZ-9的发酵滤液处理苹果树腐烂病病菌，病菌菌丝颜色变深，分支增多，末端膨大畸形，出现原生质浓缩，内含物释放的现象，抑菌效果达到75%。
　　黄腐酸是腐植酸类物质中分子量较小的一个组分，含活性官能团多，生物活性高，水溶性好，能有效促进植物生长。研究表明，黄腐酸能抑制多种植物病害。马焕普等人[5]实验中，在葡萄叶上喷施黄腐酸，降低了白腐病的发病率;许旭旦等人[6]和陈国参[7]的实验用黄腐酸处理苹果腐烂病病斑，发现能明显促进病斑周围愈伤组织的生长，且不会烧伤活体树细胞，干边率下降，从而增强抵抗腐烂病菌侵入和扩展的能力，发病机会减少。
　　壳寡糖是一种聚合度为2-20的低聚糖，通过壳聚糖降解得到，具有水溶性、广谱抑菌性，能抑制多种植物病原真菌和细菌的生长。胡健等人[8]用壳寡糖处理马铃薯环腐病菌、棉花炭疽病菌、小麦赤霉病菌时，发现其能抑制病原菌生长繁殖及真菌孢子萌发。臧珉等人[9]用壳寡糖处理棉花枯萎病菌和烟草赤星病菌，发现其能抑制病原菌菌丝的生长。
　　黄腐酸钾和壳寡糖能有效抑制多种病原真菌生长，但在施用过程中，自然界中微生物总数庞大，对特定植物病害病原菌防治效果难以确定。单独使用拮抗菌对病原菌进行防治，不能确定该拮抗菌是否会成为优势种群。本研究旨在将拮抗菌与黄腐酸钾、壳寡糖组合使用，为拮抗菌提供一个优良环境，可以促进拮抗菌成长为优势种群，抑制病原菌生长，同时诱导植物抗性，减少病害的发生。
　　本研究通过筛选出一株对苹果腐烂病有拮抗作用的放线菌，初步测定了与黄腐酸钾、壳寡糖结合后对苹果腐烂病菌的抑制情况，以期为生物防治的研究提供新思路。
　　1 材料与方法
　　1.1 土壤样品
　　河北经贸大学海棠树园患有腐烂病的果树根际土。
　　1.2 供试病原菌
　　苹果腐烂病病原菌来源河北农业大学植物病害流行与综合防控研究室。
　　1.3 供试培养基
　　拮抗菌的分离及保存用高氏一号培养基，拮抗试验用高氏一号培养基和PDA培养基，拮抗菌液体培养用MH培养基。
　　1.4 放线菌的分离纯化
　　用20目筛筛去土壤中颗粒较大的土块及杂质，取10g土壤样品，加入90mL无菌水，震荡10min，制成10-1土壤悬液，无菌条件下依次稀释得到10-4、10-5、10-6土壤悬液。吸取10-4、10-5、10-6土壤悬液0.1mL到高氏一号平板中，涂布均匀，每个浓度设3个平行;将涂布好的平板静止几分钟，放到28℃培养箱内倒置培养。培养3d后，根据不同菌落形态、气生菌丝的特点挑选单菌落，再用接种环将单菌落划线到高氏一号平板上，28℃培养7～14d后检查。将纯化3次后的菌株接种到高氏一号斜面培养基上培养7～14d，于4℃保存。
　　1.5 放线菌对苹果腐烂病抑菌活性的测定
　　采用平板对峙法[10]测定放线菌株对苹果腐烂病的抑菌活性。将高氏一号培养基和PDA固体培养基融化后按照1∶1的比例倒平板，制成高氏一号、PDA混合平板。无菌打孔器打制菌饼，将放线菌菌饼放在平板边缘，28℃培养1～2d后再将苹果腐烂病菌饼放置于平板中央，置于28℃恒温培养，计算抑菌率。计算公式如下：
　　抑菌率（100%）=（对照菌落面积-处理菌落面积）/对照菌落面积×100%
　　1.6 黄腐酸钾单因素对苹果腐烂病的抑制作用测定
　　称取黄腐酸钾溶于水配制系列浓度：3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，与PDA培养基混合，配制成所需浓度的带药培养基;将苹果腐烂病菌饼放在平板中央，28℃恒温培养，待空白对照致病菌长满平板时计算抑菌率（同上述公式）。
　　1.7 壳寡糖单因素对苹果腐烂病的抑制效果测定
　　称取壳寡糖溶于水配制成0.4%、0.5%、1%、4%、5%的壳寡糖溶液，与PDA培养基混合，配制成所需浓度的带药培养基，中间接种致病菌菌饼，28℃恒温培养。待空白对照致病菌长满平板时计算抑菌率（同上述公式）。 　　1.8 黄腐酸钾、壳寡糖与放线菌结合对腐烂病的抑制作用  将筛选得到的放线菌接种到MH培养基中，180r/min，28℃摇床培养，得到放线菌悬液，将菌悬液中菌丝球稀释得到0.25mg/mL、0.025mg/mL 2个浓度，制成菌平板最终浓度为1.25×10-2mg/mL、1.25×10-3mg/mL，标记为a、b;根据上述黄腐酸钾和壳寡糖单因素实验结果，选择高低2个不同浓度结合制作平板，在平板中央放上苹果腐烂病菌饼，判断不同高低浓度结合在一起对腐烂病抑制作用。设计L4（23）3因素2水平正交实验（表1）。
　　
　　2 结果
　　2.1 放线菌对苹果腐烂病抑制效果
　　从土壤中共分离得到12株放线菌菌株，其中5株对苹果腐烂病表现出拮抗活性，将这5株放线菌命名为Z-2、Z-4、Z-6、Z-E、XW5，具体抑菌数据见表2。结果表明，菌株Z-4、Z-E、XW5对腐烂病的抑制效果较好，但经过血平板培养后，Z-4出现溶血环，具有细胞毒性;Z-E、XW5对苹果腐烂病的抑菌率达到46.62%、50.41%，且没有溶血性，可进行后续的工作实验。本次实验选择Z-10菌株开展后续工作。
　　
　　2.2 黄腐酸钾单因素抑制苹果腐烂病效果
　　28℃恒温培养后，不同浓度黄腐酸钾对苹果腐烂病的抑制作用结果如表3所示。
　　
　　从表3可以看出，随着黄腐酸钾浓度的增大，对苹果腐烂病的抑制作用逐渐增强。0.3%黄腐酸钾的抑菌率达到85.88%，当黄腐酸钾浓度达到0.4%时，抑菌率突破90%，随着浓度越来越大，抑菌率也越来越强，0.9%的黄腐酸钾浓度达到100%抑菌效果。
　　2.3 壳寡糖单因素抑制苹果腐烂病效果
　　28℃恒温培养后，不同浓度壳寡糖对苹果腐烂病的抑制作用结果如表4所示
　　
　　从表4的结果可以看出，随着壳寡糖浓度的增高，对苹果腐烂病的抑制作用逐渐增强。壳寡糖浓度为0.1%时，表现出较强的抑菌效果，达到61.25%;壳寡糖浓度0.4%时，对苹果腐烂病的抑制率达到了100%。
　　2.4 正交试验实验结果
　　不同浓度黄腐酸钾、壳寡糖和放线菌菌液组合正交结果如表5所示。
　　此实验中，3个因素对苹果腐烂病抑菌率的影响顺序为A>B>C，最佳组合水平为A2B2C2。根据方差分析結果显示各因素水平之间抑菌率并无显著性差异。从经济成本角度来说，低浓度的各因素能够满足抑菌要求，所以生产的最佳因素组合为A1B1C1，即黄腐酸钾浓度0.3%、壳寡糖浓度0.1%、放线菌菌液浓度为1.25×10-3mg/mL。
　　
　　3 讨论
　　壳寡糖相比于壳聚糖而言，应用于植物病害防治及其它各方面更为广泛。壳聚糖和壳寡糖对于多种微生物都具有广谱的抑菌活性，但壳聚糖的分子量较大，粘度高，不溶于水和碱性介质，只能溶于酸溶液;壳寡糖分子量小，能够进入细胞进行调节，溶于水、无毒无害，所以壳寡糖用来防治苹果腐烂病是较好的选择。
　　黄腐酸作为一种富含高活性的腐植酸，在农业上的应用更为广泛，其不仅包含腐植酸的一般性质，更具有分子量小，容易渗透进细胞，使病菌的DNA复制受到抑制，含活性官能团较多，水溶性好等特点，能够增强作物免疫力，提高抗病能力，所以应用更加广泛[11]。
　　目前，微生物应用于植物病害防治中已经十分广泛，放线菌作为自然界中广泛存在的微生物，很早就被应用到植物病害的防治中。孙现超等[12]分离了一株放线菌JY-22发酵液对马铃薯干腐病菌丝生长有很强的抑制作用，对马铃薯干腐病有显著的抑制作用，达到74.5%。魏利辉等人[13]公开了一种能够防治灰霉菌的放线菌菌株及放线菌菌剂，作为一种新型农业杀菌剂，对灰霉病菌抑制率达到60%以上。上述2个放线菌抑菌实验中都是以放线菌的发酵液探索病原菌抑制效果，发酵液中代谢产物对抑制病原菌起重要作用。本研究从土壤中筛选出一株拮抗放线菌，命名为XW5，并通过平板对峙法初步测定了拮抗菌本身对苹果腐烂病的抑菌率，抑菌效果达到50.41%，有很高的利用价值。黄腐酸和壳寡糖在防治植物病害中也有研究，陈臻等人[14]用黄腐酸处理苹果腐烂病菌，黄腐酸能够显著提高苹果树体内相关防御酶系的活性，提高了植物的免疫力，增强了苹果树的抗病性;陆阳[15]将壳寡糖与青霉菌组合防治苹果腐烂病，发现防治效果明显高于二者单独施用。本实验将放线菌与黄腐酸钾、壳寡糖结合使用抑制苹果腐烂病，通过单因素实验选择不同浓度的黄腐酸钾、壳寡糖与拮抗放线菌设计正交实验，组合探索苹果腐烂病抑制效果。实验结果表明黄腐酸钾浓度0.7%、壳寡糖浓度0.4%、放线菌液10-1抑菌效果较好。从经济成本角度来说，低浓度的各因素能够满足抑菌要求，即黄腐酸钾浓度黄腐酸钾浓度0.3%、壳寡糖浓度0.1%、放线菌浓度为1.25×10-3mg/mL便能有效抑制苹果腐烂病，且抑菌率达到77.85%。
　　放线菌应用于植物病害防治中已经十分广泛，黄腐酸和壳寡糖也在植物病害的防治中展示出优势。本次实验从土壤中分离出一株对苹果腐烂病有抑制作用的放线菌，并将其与黄腐酸钾和壳寡糖结合使用抑制苹果腐烂病，在实验室阶段对其抑制作用进行了初步的鉴定，田间防治苹果腐烂病的效果将待进一步研究，以期能为后续黄腐酸钾和壳寡糖更好地应用于生物防治提供参考。
　　参考文献
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　　（责任编辑 常阳阳）
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