增效复合拮抗菌剂对烟草青枯病病原菌抑制效果研究

来源:用户上传      作者:李程 黎妍妍 杨小琼 李春黎 许玉享 王林 陈守文 杨勇

　　摘要  将实验室保藏的青枯病拮抗菌ZM9和YH-22配制成复合菌剂，并将万寿菊提取物和复合菌剂联合配制成协同菌剂，通过分析万寿菊提取物对青枯菌的抑制效果，复合菌剂和协同菌剂抑制青枯菌的效果。结果表明，万寿菊提取物对青枯菌具有抑制作用，且万寿菊提取物用量与抑制效果呈显著负相关（Pearson=-0.997，P=0.047）;万寿菊提取物对青枯病拮抗菌有一定的促进作用;复合菌剂和协同菌剂对青枯菌均有抑制作用，协同菌剂抑菌效果显著高于复合菌剂;综合分析表明万寿菊提取物可以与青枯病拮抗菌联合施用，并能增强对青枯菌病原菌抑制效果。研究结果为烟草青枯病生防菌剂的研制拓展了新的方向。
　　关键词  烟草青枯病;拮抗菌;万寿菊提取;复合菌剂;协同菌剂
　　中图分类号  S  435.72文献标识码  A
　　文章编号  0517-6611（2020）04-0128-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.038
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　The Inhibitory  Effect of  Synergistic and Compound Antagonistic Agent on Tobacco Bacterial Wilt
　　LI  Cheng1，LI  Yan-yan2，YANG Xiao-qiong1 et al  （1.School of  Life  Sciences，Hubei University，Wuhan，Hubei  430062;2.Tobacco Research Institute of Hubei Province，Wuhan，Hubei   430030）
　　Abstract  In this experiment，the antagonistic bacteria of tobacco bacterial wilt ZM9 and YH-22 preserved in our laboratory were prepared into compound bacterial agent.Marigold rhizome extract and above-mentioned compound bacterial agent were combined to prepare synergistic bacterial agent.By analyzing and comparing the inhibitory effect of marigold rhizome extract，compound bacterial agent and synergistic bacterial agent on tobacco bacterial wilt， it was found that marigold rhizome extract had an inhibitory effect on the tobacco bacteria wilt，and the amount of marigold rhizome extract was negatively correlated with the inhibitory effect （Pearson=-0.997，P=0.047）.Besides，marigold rhizome extract can promote the growth of antagonistic bacteria of tobacco bacterial wilt to some extent.According to the statistical analysis of bacteriostatic circle and plate colony number，both the synergistic bacterial agent and compound bacterial agent had inhibiting effect on tobacco bacterial wilt，but the inhibitory effect of synergistic bacterial agent was significantly higher than that of compound bacterial agent.Comprehensive analysis showed that marigold rhizome extract could combine with antagonistic bacteria of tobacco bacterial wilt ZM9 and YH-22 to enhance the inhibitory effect of tobacco bacterial wilt.The resuts of this study opened a new direction for the development of tobacco bacterial wilt biocontrol agents.
　　Key words  Tobacco bacterial wilt;Antagonistic bacteria;Marigold rhizome extract;Compound bacteria agent;Synergistic bacteria agent
　　煙草青枯病对烟叶生产的影响备受关注[1-2]，烟草青枯病防治成为烟叶生产相关领域研究热点之一[3-5]。目前防治青枯病的策略主要包括化学防治、生物防治和农艺防治[5]，其中化学防治存在后期防效差，长期施用导致病菌产生抗药性[6]，抗病品种选育成功率低是农业防治中关键性难题[7-8]，生物防治方法因其安全无公害和长效等优点成为烟草青枯病防治的热点[2，7]，其中采用生物菌剂防治烟草青枯病的方式得到相关研究领域认可[8]，且复合生防菌的应用成为主流趋势[9]。研究虽然取得了一些效果[10]，但青枯病蔓延趋势并未得到有效的控制[11]。为控制烟草青枯病的发生和蔓延，探讨和寻找新的防治方法显得尤为重要。 　　植物含有许多具有杀虫和抑菌等功效的生物活性物[12]，广泛应用于病害防治[13]。万寿菊是一种多用途作物，具有抗菌性能[14] ，利用万寿菊活性成分防治土传病害的研究较多[15-18]。但万寿菊活性成分中也有有益于微生物的成分 ，能否将万寿菊与青枯菌拮抗菌复合，并應用于烟草青枯病防治值得探讨。
　　笔者将实验室所筛选的青枯病拮抗菌配制成复合菌剂，将万寿菊提取物与拮抗菌联合配制成增效复合菌剂，既发挥万寿菊抑制青枯菌的特性，又利用万寿菊提取物中有益于拮抗菌的成分。通过对比分析测试其抗菌效果，为研制新的烟草青枯病生防菌剂提供参考。
　　1  材料与方法
　　1.1  菌种来源和培养基
　　烟草青枯病病原菌（HF-1-2）、烟草青枯病拮抗菌（ZM9和YH-22）均为笔者所在课题组筛选保藏[19-20]。
　　LB固体培养基：氯化钠 10 g，蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，1 000  mL水，加入1.8%琼脂。NA液体培养基：葡萄糖 20 g，蛋白胨 5 g，牛肉膏 3 g，1 000  mL 水，pH 7.2～7.4，固体培养基加入1.8%琼脂。TTC固体培养基：0.5 g红四氮唑（TTC）溶于100 mL蒸馏水中，经过滤灭菌后即为0.5%TTC水溶液;每100 mL NA固体培养基中加入0.5%TTC水溶液1 mL。
　　1.2  方法
　　1.2.1  拮抗菌相互拮抗效果分析。 采用稀释涂平板的方法，检测ZM9和YH-22之间的抑制作用。在LB固体平板上分别涂布ZM9和YH-22（浓度均为1.0×109CFU/mL），然后在培养基上打直径5 mm的孔，分别对应交叉加入YH-22和ZM9发酵液稀释液100 μL（释稀至10-7倍），37 ℃恒温培养12 h后测量抑菌圈直径。
　　1.2.2  拮抗菌对青枯菌抑制效果分析。采用平板对峙法，检测ZM9和YH-22对青枯病病原菌的抑制作用是否具有叠加效应。在LB固体培养基中接种青枯病病原菌100  μL（1.0×109 CFU/mL），倒平板，然后在培养基上打5 mm孔，分别加入拮抗菌ZM9和YH-22发酵液稀液100 μL（释稀至10-7倍），以及ZM9和YH-22发酵液稀释液各50 μL混匀成混合液100 μL，37 ℃恒温培养12 h后测量抑菌圈直径。
　　1.2.3  万寿菊根茎提取物对青枯菌的作用分析。 将长势良好的万寿菊拔出，根部洗净后50 ℃烘干，把根茎收集后磨碎过60目筛，即为万寿菊根茎提取物。取0、5和10 g/L万寿菊根茎提取物分别添加到NA固体培养基中，115 ℃灭菌20 min，灭菌后的固体培养基加入TTC倒平板，在平板上涂布100  μL（1.0×109 CFU/mL）青枯病病原菌HF-1-2发酵液稀释液，37 ℃恒温培养12 h后统计菌落数。
　　1.2.4  万寿菊根茎提取物对拮抗菌的作用分析。 取0、5和10 g/L万寿菊根茎提取物分别添加到LB固体培养基中，115 ℃灭菌20 min。灭菌后的固体培养基倒平板后分别涂布100  μL ZM9和YH-22发酵液稀释液（浓度均为1.0×109 CFU/mL）， 37 ℃恒温培养箱12 h后统计菌落数。
　　1.2.5  复合菌剂和协同菌剂对青枯菌抑制效果分析。 将ZM9和YH-22混合发酵制成的菌剂称作复合菌剂（FH），将复合菌剂与万寿菊根茎提取物混合制成的菌剂称作协同菌剂（XT）。在灭菌后的50 mL LB液体培养基中，分别加入3  g/L复合菌剂和协同菌剂，并接种1%的青枯病病原菌HF-1-2，以不加菌剂的为对照，37 ℃，230 r/min培养24 h;然后取培养液稀释10-7倍，再分别取稀释液100 μL涂布于加入TTC的NA固体平板， 37 ℃恒温培养12 h后观察菌体的生长情况;同时采用平板对峙法，在牛肉膏蛋白胨固体培养基中加入1%的HF-1-2菌液，倒平板，待冷却后用打孔器打出
　　直径5 mm的孔，取100 μL发酵液加入孔中，37 ℃恒温培养箱中，12 h后观察菌体的生长情况。灭菌水为对照。
　　2  结果与分析
　　2.1  拮抗菌相互拮抗效果分析  利用平板对峙法对ZM9和YH-22拮抗作用进行分析，结果显示ZM9平板打孔加入YH-22发酵液，或者YH-22平板打孔加入ZM9发酵液，均没有出现抑菌圈（图1）。
　　2.2  拮抗菌对青枯菌抑制效果分析  利用平板对峙法分析不同拮抗菌对青枯菌的抑制作用，结果显示ZM9和YH-22对青枯菌均有抑制作用，但抑制强度不同（图2a、b、c）。ZM9和YH-22对青枯菌的抑菌圈直径分别为（6.87±1.54）、 （9.23±1.30） mm，ZM9和YH-22混合后对青枯菌的抑菌圈直径为（18.13±3.26）mm，ZM9和YH-22拮抗青枯菌的抑菌圈直径差异显著（t-test，P>0.05），而ZM9和YH-22混合对青枯菌的抑菌圈直径显著大于ZM9和YH-22抑菌圈直径（t-test， PZM9=0.015，PYH22=0.032）。
　　2.3  万寿菊对青枯菌抑制作用分析  在0、5和10 g/L万寿菊提取物使用量条件下，青枯菌菌落数分别为543.67±64.45、378.67±48.95和164.67±53.51（图3a、b、c），且不同万寿菊提取物用量间青枯菌菌落数存在显著差异（t-test，P<0.05，图3d）。 　　2.4  万寿菊对拮抗菌的作用分析  添加0、5和10 g/L万寿菊提取物后ZM9的菌落数分别为284.56±39.87、303.34±42.36、326.76±22.12（图4a、b和c）;添加0、5和10 g/L万寿菊提取物后YH-22的菌落数分别为146.24±36.98，211.29±33.33和 297.58±28.96（图4e，f和g）。随着万寿菊提取物浓度升高ZM9的菌落数明显增加，但未达显著差异水平（t-test，P>0.05），而YH-22的菌落数随着万寿菊提取物浓度升高显著增加（t-test，P<0.05）（图4h）。
　　2.5  复合菌剂和协同菌剂对青枯菌抑制效果分析  利用平板对峙法分析复合菌剂和协同菌剂对青枯菌的抑制作用，结果显示复合菌剂对青枯菌的抑菌圈直径为（18.13±3.26） mm，协同菌剂对青枯菌的抑菌圈直径为（27.94±4.21） mm，均比对照大，且协同菌剂抑菌圈直径显著大于复合菌剂抑菌圈直径（t-test， P=0.011）（图5 a、b、c和 g）。平板菌落数统计结果显示，对照组、复合菌剂组和协同菌剂组青枯菌菌落个数分别为342.33±19.29、195.67±21.73和150.33±14.29（圖5 d、e和f）。复合菌剂组青枯菌菌落个数显著少于对照组（t-test，P=0.001），协同菌剂组青枯菌菌落个数显著少于复合菌剂组（t-test，P=0.047）（图5 h）。
　　3  讨论
　　烟草青枯病生物防治方法因其安全无公害和长效等优点成为烟草青枯病防治的热点[2，7]，其中复合生防菌的应用成为主流[5，9]。将功能互补的生防细菌或真菌复配混合，从而提高对作物土传病害的防治效果，达到高产的目的，已成为一种经济高效的大田作物生防方式。与单一生防菌相比，复合菌剂的防治效果更明显。Akila等[21]将真菌
　　20EC、荧光假单胞杆菌Pf1和枯草芽孢杆菌TRC54复配混合后，其对温室和大田香蕉枯萎病均有明显的防治效果;沈建平等[22]将黑曲霉，枯草芽孢杆菌、酵母、蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合成的菌剂QR-1施于烟田，烟草青枯病的发病率明显降低，防控效果达67%。该试验中的2种生防菌ZM9和YH-22复配后对烟草青枯菌抑制效果明显，ZM9和YH-22对青枯菌的抑菌圈直径分别为（6.87±1.54）和（9.23±1.30）mm，ZM9和YH-22混合后对青枯菌的抑菌圈直径为（18.13±3.26）mm，ZM9和YH-22混合对青枯菌的抑菌圈直径显著大于ZM9和YH-22抑菌圈直径（t-test， PZM9=0.015，PYH-22=0.032），与前人研究结论一致。
　　植物的花、茎、叶和根中含有大量的抑菌物质[23-24]，但将植物内源性物质与生防拮抗菌联合施用的研究并未得到重视，主要原因是植物源具有广谱杀菌性，难以与生防菌共存，
　　而当二者的抑菌物质能有效互作时，可达到更佳的抑菌效果。夏艳[25]将菌株H19与公丁香提取液以7：3的体积比进行复配组合，对烟草青枯菌的防效达64.29%;Latha等[26]将菌株Pf1、Py15、Bs16和大蒜提取液复配对番茄早疫病的防效达87%。但未有万寿菊和青枯菌拮抗菌复配防控烟草青枯菌的研究。该试验在0、5和10 g/L万寿菊提取物条件下，青枯菌菌落数分别为543.67±64.45、378.67±48.95和164.67±53.51，说明万寿菊对青枯菌抑制效果随着使用量增强而增强;另外，万寿菊对拮抗菌有一定的促进作用，ZM9和YH-22菌落数随着万寿菊提取物的增加而增加;ZM9和YH-22组成的复合菌剂对青枯菌的抑菌圈直径为（18.13±3.26）mm;ZM9，YH-22和万寿菊提取物组成的协同菌剂对青枯菌的抑菌圈直径为（27.94±4.21）mm。因此万寿菊提取物的加入对青枯菌的抑制作用明显。
　　将植物提取物和拮抗菌配制成协同菌剂既绿色环保，提高抑菌效果，还能制成可湿性粉剂，保存时间更长，运输更方便且定殖能力更强。该研究的创新之处在于在复合菌剂中添加拮抗烟草青枯菌的物质——万寿菊根茎提取物，提高抑菌效率，便于存放和运输，这将是研发绿色高效健康的协同菌剂的主要方向。
　　4  结论
　　万寿菊对烟草青枯菌具有很好的抑制作用;万寿菊可以与青枯病拮抗菌联合使用提高拮抗菌生物量，增强青枯菌抑制效果。
　　参考文献
　　[1]YULIAR，NION Y A，TOYOTA K.Recent trends in control methods for bacterial wilt diseases caused by Ralstonia solanacearum[J].Microbes Environ，2015，30（1）：1-11.
　　[2] 何明兴，沈亮，邱恒良，等.烟草青枯病的发生及防治[J].现代农业科技，2019（1）：111-112，115.
　　[3] 陈进，魏凯.烟草青枯病防治技术研究现状[J].农业与技术，2017，37（20）：35.
　　[4] 施河丽，孙立广，谭军，等.生物有机肥对烟草青枯病的防效及对土壤细菌群落的影响[J].中国烟草科学，2018，39（2）：54-62.
　　[5] 张仁军，魏刚，杨兆忠，等.几种生物菌剂防治烟草青枯病药效试验[J].现代农业科技，2019（6）：79-81.
　　[6] JANSE J D，WENNEKER M.Possibilities of avoidance and control of bacterial plant diseases when using pathogen-tested （certified） or-treated planting material[J].Plant pathology，2002，51（5）：523-536. 　　[7] 姜乾坤，彭阁，王瑞，等.抗青枯内生细菌的筛选及其对烟草青枯病的防治效果[J].中国烟草科学，2017，38（5）：13-17，31.
　　[8] LI X L，SHEN J P，YANG Z W，et al.Control effect of different microbial agents on tobacco bacterial wilt[J].Plant diseases and pests，2017，8（3）：35-38.
　　[9] 吕建林，刘二明，柏连阳，等.烟草青枯病生防菌混合接种对其定殖及防效的影响[J].中国生物防治，2010，26（2）：200-205.
　　[10] 李勇，卓东.烟草青枯病综合防治方法及其研究进展[J].南方农业，2011，5（6）：43-45.
　　[11] 杨佩文，杨群辉，倪明，等.烟草青枯病发生流行气象因素分析及土壤调理防控技术[J].西南农业学报，2017，30（5）：1104-1108.
　　[12] KARIM H，BOUBAKER H，ASKARNE L，et al.Use of Cistus aqueous extracts as botanical fungicides in the control of Citrus sour rot[J].Microbial pathogenesis，2017，104：263-267.
　　[13] 李婷，周月，宋丽雅，等.植物抑菌剂抑菌机理的研究方法进展[J].北方园艺，2016（4）：179-184.
　　[14] 郭耀东，牛仙，任嘉瑜.万寿菊资源综合开发利用研究进展[J].商洛学院学报，2019，33（2）：18-23.
　　[15] 胡中芳.万寿菊杀虫、抑菌活性的研究[J].生物学通报，2017，52（11）：52-54.
　　[16] 王鹤霖，汤华成，潘旭琳，等.万寿菊α-三联噻吩抗菌膜对冷鲜猪肉保鲜效果影响[J].食品科技，2018，43（9）：142-145.
　　[17] 陈红兵，王金胜，张作刚，等.万寿菊根的提取物对西瓜枯萎病反应的抗性研究[J].植物病理学报，2003，33（5）：439-443.
　　[18] 吴文涛，薛美静，张靖，等.万寿菊烟草多样性种植对土壤肥力相关的菌群和土壤酶活的影响[J].分子植物育种，2018，16（23）：7907-7912.
　　[19] WU B，WANG X，YANG L，et al.Effects of Bacillus amyloliquefaciens ZM9 on bacterial wilt and rhizosphere microbial communities of tobacco[J].Applied soil ecology，2016，103：1-12.
　　[20] 楊欢，余君，王昌军，等.烟草青枯病生防菌YH-22抗病机制的初步研究[J].中国烟草科学，2014，35（3）：61-66.
　　[21] AKILA R，RAJENDRAN L，HARISH S，et al.Combined application of botanical form μLations and biocontrol agents for the management of Fusarium oxysporum f.sp.cubense （Foc） causing Fusarium wilt in banana[J].Biological control，2011，57（3）：175-183.
　　[22] 沈建平，李小龙，李红丽，等.不同菌剂防治烟草青枯病的效果[J].湖北农业科学，2017，56（4）：666-669.
　　[23] 吴新安，花日茂，岳永德，等.植物源抗菌、杀菌活性物质研究进展（综述）[J].安徽农业大学学报，2002，29（3）：245-249.
　　[24] 蔺蓓蓓，徐尤美，吴三桥，等.秦岭植物源抗菌活性物质的研究进展[J].安徽农业科学，2018，46（13）：15-19.
　　[25] 夏艳.拮抗细菌与植物源提取物复配防治烟草青枯病研究[D].北京：中国农业科学院，2014.
　　[26] LATHA P，ANAND T，RAGUPATHI N，et al.Antimicrobial activity of plant extracts and induction of systemic resistance in tomato plants by mixtures of PGPR strains and Zimmu leaf extract against Alternaria solani[J].Biological control，2009，50（2）：85-93.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15140887.htm