丹东地区黄菇娘病毒病病原初步鉴定及分析

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　　摘 要：2018年7月在丹东市的黄菇娘冷棚内出现“白果”症状，该病害症状表现为浆果苞叶（宿萼）失绿变白、浆果褐色油化、叶片花叶及黄化，植株提前拉秧导致严重减产，田间传播速度快，危害严重，症状表现疑似病毒病。采用生物学鉴定和分子生物学鉴定法对黄菇娘“白果病”的病原进行鉴定。生物学鉴定采用汁液摩擦接种法，接种出现典型症状后继续观察40天，在普通烟NC89上仅有花叶、畸形，无其他症状;心叶烟新生叶片上无花叶症状，初步判断该样品无黄瓜花叶病毒（CMV）。为排除黄瓜花叶病毒（CMV）侵染，对样品进行RT-PCR扩增，克隆测序结果表明，在预期大小处没有出现条带，且经过多次试验均没有得到预期大小条带，表明病样中不含黄瓜花叶病毒（CMV），因此推断“白果病”是由烟草花叶病毒（TMV）侵染，本文首次报道了TMV侵染黄菇娘。
　　关键词：黄菇娘;白果;病毒病;病原鉴定
　　黄菇娘学名毛酸浆（Physalis pubescens L.），东北称黄菇娘、灯笼果，为茄科酸浆属草本药食两用植物，常作一年生栽培，生育期120天左右，需有效积温2600℃以上，近年来在我国东北部分地区开始种植，同时具有较高的经济效益。近几年在东北地区出现了一种黄菇娘“白果病”，该病害发生后，种植户损失惨重，病害症状表现为浆果苞叶（宿萼）失绿变白、浆果油化、叶片花叶及黄化，植株提前拉秧导致严重减产。该病害病棚率100%，发病株率近100%、减产20%～50%，所产白皮油化果失去食用价值，田间传播速度快，危害严重，症状表现疑似病毒病。
　　2018年6月在丹东地区部分冷棚黄菇娘植株出现“白果”症状，同时植株叶片出现“花叶”，田间调查发病率达20%～25%。对黄菇娘“白果”进行病原的初步鉴定和分析，推断黄菇娘病样以烟草花叶病毒（TMV）或TMV为主要毒源。该研究旨在为黄菇娘“白果病”的诊断鉴定和田间防治奠定理论基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　供试黄菇娘“白果病”样品采自凤城市发生黄菇娘病害的冷棚内。盆栽心叶烟、普通烟（NC89）、三生烟（NN）、黄瓜和蚕豆。因怀疑有CMV侵染，根据CMV外壳蛋白序列设计一对引物，P1：ATGGACAAATCTGAATCAACC，P2：TAAGCTGGATGGACAACCCGT。
　　1.2 生物学鉴定法
　　采用汁液摩擦接种法。取典型症状的叶片和白果分别加入0.01MPBS（pH：7.2）充分研磨，分别接种在心叶烟、普通烟（NC89）、三生烟（NN）、黄瓜、蚕豆上。每种盆栽选取3盆，每盆接种4～5片叶。
　　1.3 分子生物学鉴定法（RT-PCR）
　　因怀疑有CMV侵染，根据CMV外壳蛋白序列设计一对引物，P1  ATGGACAAATCTGAATCAACC， P2  TAAGCTGGATGGACAACCCGT。
　　取叶片0.5克加入液氮在研钵中研磨，吸取1毫升Trizol试剂继续充分研磨后转至1.5毫升的离心管中，室温下静置5分钟后加入200微升氯仿涡轮振荡15秒，室温下放置5分钟，12000克，4℃离心15分钟，转移上清于一个新离心管中，加600微升异丙醇混匀后于室温下静置10分钟，12000克，4℃离心15分钟，倒掉上清，沉淀加1毫升75%的乙醇清洗1次，吸掉上清后室温干燥3～5分钟，加入30微升DEPC ddH2O溶解总RNA。
　　以植物的总RNA为模板，用特异性下游引物（20pmol）1微升，5x Reaction Buffer4微升，RNase Inhibitor（20U/微升）1微升，dNTP  Mix（10mmol/L）2微升，M-MuLV RT （200U/微升）1微升。混匀后，42℃孵育1h扩增cDNA。
　　取反转录产物cDNA1微升，分别加入Ex taq 0.125微升，10x Ex taq2.5微升，d NTP Mix 2微升，P1、P2各2微升，加ddH2O补充至25微升。
　　扩增条件：94℃4分钟（预变性），94℃45秒（變性），55℃45秒（退火），72℃2分钟，30个循环（延伸）;72℃10分钟，电泳。PCR扩增产物于1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色后，置凝胶于Image Master紫外成像系统上观察并摄像。
　　2 结果与分析
　　黄菇娘“白果病”田间发病症状为心叶表现花叶、畸形（图1）;果实白果、小、畸形（图2）。
　　黄菇娘病叶和病果汁液摩擦后均在心叶烟、三生烟上产生局部枯斑，在普通烟上先是表现明脉，后表现花叶、畸形;在黄瓜、蚕豆上均无症状，根据在鉴别寄主上反应症状判断为由烟草普通花叶病毒（Tobacco mosais virus， TMV）侵染所致（表1，图3）。
　　接种表现典型症状后继续观察至40天，在普通烟上仅有花叶、畸形，无其他症状;心叶烟新生叶片上无花叶症状，初步推断该样品无黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）。
　　结果表明，在预期大小处没有出现条带，且经多次试验均未得到预期大小的条带，说明此病样中不含有CMV。
　　
　　3 讨论与结论
　　冷棚黄菇娘产业属新兴致富产业，科研部门对该作物研究处于空白区，农户种植处于摸索种植阶段，农民缺少科学系统种植技术和病虫害防控技术。黄菇娘“白果病”的发生对该作物生产造成严重危害，农民损失严重，部分病害危害已超过农户损失承受能力，农民不得不放弃该产业种植。本研究通过生物学研究法和分子生物学鉴定法对黄菇娘“白果病”的病原进行了鉴定与分析。鉴定黄菇娘白叶病病原有烟草花叶病毒（TMV）侵染，TMV侵染黄菇娘导致病毒病属首次发现，国内尚未见报道。
　　研究结果表明，黄菇娘病样的花叶和白果均由烟草花叶病毒（TMV）引起或TMV为主要毒源。经查阅相关文献，烟草花叶病毒简称TMV，病毒粒体杆状，大小300纳米×18纳米。TMV病毒是寄主范围最广、危害最大、抗逆性最强、防治最难的植物病毒。钝化温度90～93℃10分钟，稀释限点1000000倍，体外保毒期72～96小时。在干燥病组织内存活30年以上。该病毒有不同株系，我国主要有普通株系、番茄株系、黄斑株系和珠斑株系等4个株系，因致病力差异及与其他病毒的复合侵染而造成植物病毒病症状的多样性。黄菇娘为茄科酸浆属，因此极易被烟草花叶病毒（TMV）侵染。烟草花叶病毒主要侵染茄科植物，如烟草花叶病毒病、马铃薯病毒病、番茄病毒病和青椒病毒病。鉴于黄菇娘病毒病TMV毒原特性及侵染规律，在后续研究中，将参照TMV侵染烟草和番茄等茄科植物病毒病防治技术，按照“预防为主，综合防治”植保方针，做到种子消毒、轮作换茬、卫生栽培、早期防蚜、药剂控制，尽量降低黄菇娘病毒病的发生。
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