烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的抗药性检测

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　　摘  要：为了解吉林省和黑龙江省烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的抗性水平，采用菌丝生长速率法，测定了318株烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的药剂敏感性，建立敏感基线。运用最低抑制浓度法确定抗性菌株及频率，并比较不同采样地点的抗性水平。结果表明，供试敏感菌株对菌核净的敏感性频率分布呈连续的单峰曲线，接近正态分布，其EC50均值2.916 μg/mL可作为两省烟草赤星病菌对菌核净的敏感基线，抗性频率为21.38%;烟草赤星病菌对苯醚甲环唑的敏感基线为1.198 μg/mL，抗性频率为18.24%。吉林省和黑龙江省烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑产生了不同程度的抗性，不同地点抗性水平存在差异。本研究为烟草赤星病菌的抗药风险评估奠定了基础，为制定吉林和黑龙江两省烟草赤星病科学防治策略和科学用药提供了依据。
　　关键词：烟草赤星病菌;抗药性;菌核净;苯醚甲环唑
　　Resistance Assessment of Alternaria alternata Causing Tobacco Brown Spot to Dimethachlon and Difenoconazole
　　CHEN Changqing， WANG Runlin， JIANG Yun， NIU Junke， YAN Dong， MIAO Chengqi， GAO Jie*，
　　ZHAO Xue， TIAN Xinyue， ZHANG Xiaorui
　　（Jilin Agricultural University， Jilin 130118， China）
　　Abstract： To understand the resistance level of Alternaria alternata to dimethachlon and difenoconazole in Jilin and Heilongjiang Provinces， the sensitivity of 318 isolates of A. alternate to the two fungicides was determined by the method of mycelial growth rate and the sensitivity baseline to dimethachlom and difenoconazole were established. The resistant isolates and frequency were determined using the method of minimum inhibitory concentration and the levels of resistance risk of different locations were also evaluated. The results showed that the distribution of sensitivity frequency of isolates was a continuous single peak curve， which was close to the normal distribution. Therefore， the average value of EC50 with 2.916 μg/mL could be used as the sensitivity baseline of A. alternata to dimethachlon in both provinces and the resistance frequency was 21.38%. The sensitivity baseline of A. alternata to difenoconazole was 1.198 μg/mL and its resistance frequency was 18.24%. There was different resistance for the isolates to dimethachlon and difenoconazole between Jilin Province and Heilongjiang Province， and the resistance level in each regions was different. This study would lay the foundation of the resistance risk assessment and provide evidence to develop a scientific strategy to control tobacco brown spot disease in Jilin and Heilongjiang Provinces.
　　Keywords： Alternaria alternata; fungicide resistance; dimethachlon; difenoconazole
　　煙草赤星病（Tobacco brown spot）是由链格孢菌（Alternaria alternate）引起的烟草主要叶部病害，也是常发性叶部病害，在世界各地均有发生[1]，具有潜育期短、间歇性爆发流行的特点，不仅在收获期前烟田发生，而且能在烟叶进入烤房后继续发展危害[2]，危害严重时减产可达50%以上，是烟草安全生产的严重威胁和优质烟生产的一大障碍[3]。目前化学防治在烟草赤星病防治中仍是一种重要手段，尤其在生物菌剂预防效果不理想的情况下，化学药剂作为重要的应急措施发挥了关键作用。菌核净在上世纪70年代开始应用于烟草赤星病的防治[4]，目前仍是防治烟草赤星病的主推药剂[5]。然而，由于菌核净在生产上的长期大量使用以及使用的不合理，已导致抗药菌株的产生，云南、贵州等地已有烟草赤星病菌抗药性的报道[6-7]。苯醚甲环唑属三唑类杀菌剂，具有良好的内吸性，杀菌谱广，能够通过抑制麦角甾醇的生物合成而干扰病菌的正常生长，对子囊菌纲、担子菌纲、无性孢子类具有较好的抑制效果[8]。陈杰等[9]报道10%苯醚甲环唑水分散粒剂对烟草赤星病的防效达到90.60%，是近年来用于防治赤星病等叶斑病的特效药剂。吉林省和黑龙江省是我国重要的烟叶生产基地，也是赤星病的重灾区和菌核净频用地区。但目前关于吉林省和黑龙江省烟区烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的抗药性水平尚未明确。为此，本研究针对两省烟区的烟草赤星病菌开展了2种药剂的抗药性检测分析，以期为两省该病原菌的抗性风险评估提供理论依据，为制定有效的药剂防治策略奠定基础。 　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　供试菌株：2017年7—9月在吉林省13个烟草种植乡镇和黑龙江省7个乡镇采集具有烟草赤星病典型症状的叶片，通过单孢分离方法，共获得菌株318株，其中吉林省175株，黑龙江省143株，菌株来源详见表1。
　　供试杀菌剂：93%菌核净原药和96%苯醚甲环唑原药均由武汉远程共创科技有限公司生产。
　　含药培养基的制作：93%菌核净原药和96%苯醚甲环唑原药用甲醇溶解，配成104 μg/mL母液，4 ℃贮藏备用。使用时将母液用无菌水分别稀释配制成质量浓度分别为0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL的系列浓度，以10%药液量加入灭菌且溶化
　　状态的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（冷却至45～50 ℃）中充分摇匀，制成含药平板。
　　1.2  方法
　　1.2.1  烟草赤星病的敏感性测定  采用菌丝生长速率法[10]。将供试菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，28 ℃恒温培养7 d后，制成直径为8.0 mm的菌饼，且将菌饼分别接种到1.1中配置的含药平板中央，每个处理重复3次，28 ℃恒温培养，以不含药平板为空白对照，7 d后采用十字交叉法测量各处理的菌落直径，根据公式（1）计算抑菌率：
　　抑菌率/%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100            （1）
　　采用Excel 2013和SPSS 22统计软件对数据进行处理与分析。以菌丝生长抑制率的几率值为y坐标，药剂浓度的对数值为x坐标，计算毒力回归方程y=a+bx及有效抑制中质量浓度EC50值。运用最低抑制浓度法[11]鉴别敏感菌株并对敏感菌株进行正态检验，以每个敏感菌株EC50值的对数值为横坐标，菌株分布频率为纵坐标，绘制敏感性频率分布柱状图。当病原菌群体的EC50值频率呈正态分布时，可将该群体的EC50均值作为病原菌对药剂的敏感基线[8，12]，采用Shapiro-Wilk法对EC50值进行正态分布检验：p>0.05则符合正态分布，反之则为非正态分布。
　　1.2.2  抗药性水平的划分  抗药性水平的划分参照席亚东等[13]的方法，测定菌株的抗性倍数，如公式（2）：
　　抗性倍数=测定菌株的EC50/敏感基线  （2）
　　根据抗性倍数将供试菌株划分为敏感、低抗、中抗和高抗菌株，标准如下：
　　敏感：抗性倍数≤5
　　低抗：5<抗性倍数≤10
　　中抗：10<抗性倍数≤100
　　高抗：抗性倍数>100
　　根据抗药性菌株在群体中的出现频率计算出抗药性菌株频率，如式（3）：
　　抗性菌株频率/%=抗性菌株/供试菌株×100
　　（3）
　　2  结  果
　　2.1  烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的敏感性和敏感基线
　　如图1A所示，318株供试菌株对菌核净的敏感性呈连续性分布，其中EC50最小值为0.0075 μg/mL，最大值为430.47 μg/mL。运用最低抑制浓度法鉴定获得敏感菌株97株，对敏感菌株的EC50值取对数，采用Shapiro-Wilk法分析得知p=0.125>0.05，表明烟草赤星病菌对菌核净的敏感性频率呈近似正态分布。因此，其EC50均值（2.916±0.231） μg/mL可作为烟草赤星病菌对菌核净的敏感基线。
　　318株供试菌株对苯醚甲环唑的敏感性呈连续性分布（图1B），其中EC50最小值为0.0046 μg/mL，最大值为637.86 μg/mL。运用最低抑制浓度法鉴定获得敏感菌株232株，对敏感菌株EC50值取对数，采用Shapiro-Wilk法分析得知其p=0.08>0.05，表明病原菌对苯醚甲环唑的敏感性频率呈近似正态分布。因此，其EC50均值（1.198±0.122） μg/mL可作为烟草赤星病菌对苯醚甲环唑的敏感基线。
　　2.2  吉黑两省烟草赤星病菌对菌核净的抗性频率及分布
　　吉林省烟草赤星病菌对菌核净敏感菌株139株，抗性菌株36株，抗性频率为20.57%，其中低抗菌株占8.64%，中抗菌株占10.23%，高抗菌株为1.70%（表2）。不同采样地点抗性频率有一定差异，其中白城市平安镇菌株对菌核净抗性频率最低为0，大安市叉干镇和洮南市黑水镇的菌株对菌核净抗性频率最高，达到42.86%。
　　黑龙江省烟草赤星病菌对菌核净敏感菌株111株，抗性菌株32株。抗性频率22.38%，高于吉林省抗性频率，其中低抗频率13.99%，中抗频率7.69%，高抗频率0.70%（表3）。烟草赤星病菌株对菌核净的抗药性以低抗和中抗水平为主，高抗菌株较少。不同采样点之间抗药性存在差异，哈尔滨市常安镇抗性频率最高为37.5%，而肇东市黎明镇尚未检测到抗药性，抗性频率为0%。
　　2.3  吉黑两省烟草赤星病菌对苯醚甲环唑的抗性频率及分布
　　吉林省煙草赤星病菌对苯醚甲环唑敏感菌株149株，抗性菌株26株，抗性频率为14.86%，低于对菌核净的抗性频率，其中低抗菌株占6.14%，中抗菌株4.65%，高抗菌株4.07%（表4）。不同采样点之间抗性菌株频率差异较大，大安市舍力镇抗药性最高，抗性频率达85.71%，大安市叉干镇和龙井市三合镇未检测到抗性菌株。
　　黑龙江省烟草赤星病菌对苯醚甲环唑敏感菌株111株，抗性菌株32株，抗性频率22.38%，高于吉林省抗性频率，其中低抗频率8.81%，中抗频率5.71%，高抗频率7.86%（表5）。不同采样点之间抗性频率有明显差异，其中哈尔滨市常安镇抗性频率最高达64.29%，大庆市肇州镇和哈尔滨市宁远镇未检测出抗药性菌株。与表3相比，苯醚甲环唑在黑龙江省整体抗性频率高于菌核净，高抗频率是菌核净的11.73倍，低抗和中抗频率低于菌核净。 　　2.4  不同地点烟草赤星病菌对两种药剂的抗性比较分析
　　如图2所示，黑龙江省大庆市肇州镇、哈尔滨市宁远镇和吉林省大安市叉干镇、龙井市三合镇烟草种植区检测出对菌核净有中高抗性菌株群体，而对苯醚甲环唑未检测到抗性菌株;龙江肇东市黎明镇和吉林省白城市平安镇对菌核净无抗药性菌株出现;黑龙江省大庆市永胜乡、哈尔滨市常安镇、宁安市宁安镇和吉林省和龙市头道镇、洮南市黑水镇、延边州汪清镇、德惠市大房身镇、大安市舍力镇、延吉市依兰镇检测出对菌核净和苯醚甲环唑均有中高抗性菌株群体;吉林省通化市柳河镇、松原市弓棚子镇、延边州万宝镇检测出少数对两种药剂均产生中低抗性的菌株。
　　3  讨  论
　　本研究测定了吉林省和黑龙江省20个烟草主要种植乡镇的烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的敏感性，并建立了敏感基线，研究发现吉林省和黑龙江省赤星病菌对菌核净已经产生了抗药性群体，抗性菌株频率21.38%，个别地点抗药性频率偏高，大安市叉干镇的抗性频率达42.86%，哈尔滨市常安镇抗性频率达37.5%。本试验所获得的吉黑两省烟草赤星病菌对菌核净的抗性菌株频率均低于云南省[6]和贵州省[7]水平。张彬彬等[14]报道山东省田间烟草赤星病菌对苯醚甲环唑保持较高的敏感性，未出现敏感性降低的亚群体。本研究率先进行了烟草赤星病菌对苯醚甲环唑的抗药性检测，发现吉黑两省烟草赤星病菌对苯醚甲环唑的敏感基线为1.198 μg/mL，抗性频率分别为14.86%和22.38%，低于菌核净的相应指标，但已经出现了抗药性群体。不同地点菌株群体对2种药剂的抗性水平存在差异，本试验开展赤星病菌抗性风险评估和交互抗性等研究，为推荐合理用药奠定了基础。例如，病原菌对菌核净和苯醚甲环唑以中高抗性水平为主的地区应该减少继续使用两種药剂，筛选和开发新的有效防治烟草赤星病菌的药剂，低抗水平地区可以交替用药，对其中一种有抗性的地区可以采用替代药剂进行防治等。
　　近年来，经过烟草行业科研工作者不懈努力和深入研究，对烟草赤星病的防治取得了较大进步。但由于该病原菌生理小种多变，气候环境异常，缺少高抗品种等因素影响，使得此病的发生呈逐年上升趋势[15]。为更好地可持续防治烟草赤星病，减少抗药性产生，查明地区抗性差异的形成因素尤为重要。此外，病原菌抗药性的产生也可能与农耕条件、气候条件、施药方式、施药种类和施药量等多因素有关。因此，防治烟草赤星病需要加强抗病品种选育利用、农业栽培措施的管理，定期做好抗性监测工作，注意药剂的交替和轮换使用。
　　4  结  论
　　本研究明确了吉林省和黑龙江省烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的敏感性，确定了敏感基线。不同地点菌株群体对两种药剂的抗性水平存在着一定的差异，根据低中高抗性频率，可为生产上防治该病害提出科学合理用药建议和要求，避免和降低抗药性的产生，有效防治病害。
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　　基金项目：吉林省烟草公司烟草绿色防控重大专项“吉林省烟草有害生物绿色防控技术的创新、集成与示范”（2017220000270029）
　　作者简介：陈长卿（1978-），男，副教授，博士、硕士生导师，主要从事植物病害综合防治。E-mail：ccqjy@163.com
　　*通信作者，E-mail：jiegao115@126.com
　　收稿日期：2019-08-17               修回日期：2019-11-17
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