湖北枣阳烟区烟叶赤星病病原鉴定
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作者:周鹏 朱闻君
摘要 为明确湖北枣阳烟区烟草赤星病病原菌的種类，给产区综合防治烟草赤星病提供依据。从枣阳烟区采集典型烟草赤星病样本进行病原菌分离，在致病性测定的基础上通过形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定。结果显示，分离出的菌株ZY-1为烟草赤星病病原菌，其分生孢子卵形或椭圆形，褐色，具有3～6个横隔膜和1～4个纵隔膜，分生孢子链较短呈树状，多分枝，病原菌rDNA-ITS 序列分析结果表明，菌株ZY-1与链格孢（A.alternata）同源性最高，达100%。结合形态学和分子生物学鉴定结果，确定为链格孢（A.alternata），这是首次在湖北枣阳烟区发现由链格孢（A.alternata）引起的烟草赤星病。
关键词 烟草赤星病;链格孢;分子鉴定
中图分类号 S435.72 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0146-03
Abstract Typical disease spot specimens were collected from different areas and pathogen isolation and pathogenicity tests were carried out to determine tobacco brown spot pathogen species in Zaoyang area of Hubei and providing basis for comprehensive control of tobacco brown spot. The results showed that the strain ZY-1 isolated from disease spot were confirmed to be pathogens of tobacco brown spot. Its conidia are oval with 3-6 diaphragms and 1-4 mediastinal membranes. The sporangial chains were mostly shortbranched. The results of sequences analysis of rDNA - ITS showed the strain ZY-1 had the highest homology with A. alternata， up to 100%. The pathogen was identified as A. alternata based on the results of morphological and molecular biology identification. It was the first time that A. alternata caused tobacco brown spot was found in Zaoyang of Hubei Province.
Key words Tobacco brown spot;A. alternata;Genetic identification
流行速度快等特点，在温湿度适宜时，短时间内即可造成大面积病害流行，严重影响烟叶的产量和品质，降低工业使用价值，给烟叶生产带来巨大损失[2]，已成为烟叶生产可持续发展中亟待解决的关键问题之一。
引起烟草赤星病的病原菌属于半知菌类，链格孢属。该病主要发生在烟草大田生长中后期，从烟株下部叶开始发生，病斑自上而下逐步发展，典型症状是初期为黄褐色圆形小点，以后扩大到1～2 cm，病斑圆形或不规则圆形，周围有黄色晕圈，上面产生明显的以病斑中央为圆心的同心轮纹，质脆、易破碎，严重时病斑愈合形成大的病斑[3]。
目前已知引起烟草赤星病的链格孢种类有链格孢（A.alternata）、长柄链格孢（A.longipes）、鸭梨链格孢（A.yaliinficiens）、细极链格孢（A.tenuissima）4个种[4-5]。山东部分地区烟草赤星病的病原菌主要为链格孢（A.alternata）[6]，湖北各烟区烟草赤星病主要病原菌有链格孢（A.alternata）、长柄链格孢（A.longipes）、鸭梨链格孢（A.yaliinficiens）、细极链格孢（A.tenuissima）4个种，其优势种群为长柄链格孢（A.longipes）[7]，河南省烟草赤星病病原菌为链格孢（A.alternata）、长柄链格孢（A.longipes）和鸭梨链格孢（A.yaliinficiens）3个种[4]，贵州省烟草主栽区赤星病病原菌为链格孢（A.alternata）、长柄链格孢（A.longipes）[2]，彭希文等[8]鉴定出云南烟区烟草赤星病病原菌有链格孢（A.alternata）、长柄链格孢（A.longipes），胡中会等[9]对云南省28个产烟区28个供试菌株进行了rDNA- ITS 序列分析，28个供试菌株与GenBank 中登录的链格孢属7 个种（包括5个小孢子种Alternaria citri，A.alternata，A.longipes，A.mali，A.gaisen和2个大孢子种A.porri，A.solani）14个菌株的序列进行了聚类分析。
笔者提取供试菌株基因组DNA，采用形态学及rDNA-ITS序列分析的分子生物学方法鉴定湖北省襄阳市枣阳烟区烟草赤星病病原菌类型，以期为湖北枣阳烟区烟草赤星病的流行监测及综合防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料于2019年6月从湖北襄阳市枣阳市清潭镇不同烟田采集具有烟草赤星病典型特征的病叶样品。
1.2 培养基及试剂
①PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至1 000 mL。 ②PCR及电泳所需试剂：Taq PCR Master Max（包括 0.1 U/μL Taq DNA polymerase，0.4 mmol/L each dNTP 2×Taq Buffer，PCR enhance reagent and proteide steady reagent）。
③试验所用引物由上海桑尼生物技术有限公司合成。
1.3 方法
1.3.1 病原菌分离。
采用组织分离法分离病原菌。在带有烟草赤星病典型特征的病叶病斑处，用剪刀或解剖刀从病健交界处切取3～4 mm大小的病组织数块，先用75%乙醇消毒30 s，0.1%升汞溶液消毒30 s，再用无菌水漂洗3次，后用灭菌的滤纸吸干组织表面的水分，移至PDA培养基平板上，置于温度25 ℃、相对湿度75%、12 h/12 h光暗交替的恒温培养箱中培养5～7 d。
1.3.2 病原菌的纯化。
用无菌接种针挑取培养物菌落边缘少许菌丝于新的PDA平板培养基上培养，重复纯化3次，获得菌株的纯培养。纯化的菌株移入PDA斜面于4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.3 病原菌致病性测定。
采用离体叶片接种法，取湘烟三号的新鲜健康叶片，用70%乙醇表面消毒后再用无菌水冲洗2～3次，放入消过毒的培养皿中，用直径6 mm的打孔器在培养7 d的PDA平板上打取边缘菌丝块，接种至叶片上，用保鲜膜封培养皿保湿，置于25 ℃恒温培养箱中培养。叶片发病后，从病斑上再次分离病原物，比较其与接种用的菌株形态特征是否一致。
1.3.4 病原菌的形态学鉴定。
将分离得到的致病菌株在PDA培养基上于25 ℃培养箱中培养，7 d后观察菌落形态、颜色等形态学特征。将单孢菌株接种到PDA平板上，培养箱培养5～7 d后，在无菌条件下用灭菌的刮铲或棉签刮掉平板上的菌丝，再放入培养箱中培养2～5 d，在显微镜下观察分生孢子梗。用移液枪移取5 mL灭菌水，用刮铲轻刮菌落，再用灭菌的脱脂纱布过滤，取2～3 mL过滤后的菌液制成玻片，在光学显微镜下观察病菌的分生孢子形态。
1.3.5 病原菌的分子生物学鉴定。
参考Sambrook等[10]的方法，采用CTAB法提取病原菌基因组DNA，以其总DNA为模板，用真菌生物核糖体DNA通用引物ITS1和ITS4对病原菌rDNA-ITS区进行PCR扩增。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳和0.5 μg /mL溴化乙锭（EB）溶液染色后检查扩增结果。用DNAMAN（版本5.2.2）软件校对、拼接供试菌株的ITS区序列（包括ITS1、58S rDNA 和ITS2）序列，然后与互联网GenBank核酸数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）中的ITS区相关序列进行同源性比较。
2 结果与分析
2.1 烟草赤星病病原菌分离及致病性测定
从湖北枣阳烟区不同烟田分离获得一株病原菌，命名为ZY-1，对分离纯化的病原菌菌株进行致病性测定，能引起健康烟叶产生病斑，病斑从接种点逐渐扩展，病斑为褐色，周围有黄色晕圈（图1）。
2.2 病原菌形态学鉴定
病原菌在PDA培养基上培养7 d后，菌落圆形，呈灰白色，菌落边缘气生菌丝绒状，气生菌丝发达，菌落边缘有淡黄色的环带。分生孢子卵形或椭圆形，褐色，具有3～6个横隔膜和1～4个纵隔膜，分生孢子链较短呈树状，多分枝。参照张天宇[11]对链格孢属真菌形态特征的描述，及杨涛等[7]、祖艳青等[4]、唐承成等[2]对烟草赤星病病原菌的分离鉴定结果，初步鉴定分离的病原菌为链格孢（A.alternata）（图2）。
2.3 病原菌分子鉴定
用真菌生物核糖体DNA通用引物ITS1和ITS4对病原菌rDNA-ITS区进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，扩增出的片段长度约为600 bp（图3）。将测序结果在GenBank中进行同源性比较，发现供试菌株与链格孢（A.alternata）同源性最高，达100%。结合形态学和分子生物学鉴定结果，该病原菌为链格孢（A.alternata）（表1和图4）。
3 结论与讨论
不同地区引起烟草赤星病的种类不同，目前已知引起烟草赤星病的链格孢种类主要有链格孢（A.alternata）、长柄链格孢（ A.longipes）、鸭梨链格孢（A.yaliinficiens）、细极链格孢（A.tenuissima）4个种，黎妍妍等[5]、万科[12]、关博元等[13]对4种烟草赤星病病原菌的致病力进行了测定，发现4种烟草赤星病病原菌的致病力存在显著差异，温度、pH、碳氮源利用等生物学特性上也存在差異。因此对病原菌种类进行分类，能为烟区制定针对性防治措施提供参考。该研究通过形态学和分子生物学方法对湖北襄阳市枣阳烟区烟草赤星病病原菌进行鉴定，结果发现引起枣阳烟区烟草赤星病的病原菌为链格孢（A.alternata），这是在湖北襄阳枣阳烟区首次发现由链格孢（A.alternata）引起的烟草赤星病。
参考文献
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安徽农业科学 2020年
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