新疆棉花枯、黄萎病的发生现状及其快速分离技术

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　　摘要 为明确新疆不同地区造成棉花萎蔫，维管束变褐的病原菌种类及其发生现状，本研究对新疆47个主要植棉区有萎蔫症状且维管束变褐的棉花病株进行了分离鉴定，并对其快速分离鉴定方法进行了改进。结果表明：南疆20个地点，得到358个纯化菌株，黄萎病菌占81.8%，枯萎病菌占18.2%;北疆27个地点，得到495个纯化菌株，黄萎病菌占93.9%，枯萎病菌占6.1%。南北疆均以黄萎病为主，枯萎病南疆重于北疆。维管束病害的快速分离方法每分离一个样品只需2 min，污染率仅为6.7%。
　　关键词 棉花; 黄萎病; 枯萎病; 快速分离鉴定方法
　　中图分类号： S 435.621.2
　　 文献标识码： A
　　 DOI： 10.16688/j.zwbh.2019092
　　Occurrence of cotton Fusarium and Verticillium wilt in Xinjiang and the rapid isolation method
　　ZHANG Guoli1， XIE Zongming1， FENG Zili2， LI Quansheng1， ZHU Heqin2， L Ning1， SUN Guoqing1，3
　　（1. Xinjiang Production & Construction Group Key Laboratory of Crop Germplasm Enhancement and
　　Gene Resources Utilization， Biotechnology Research Institute， Xinjiang Academy of Agricultural and
　　Reclamation Sciences， Shihezi 832003， China; 2. State Key Laboratory of Cotton Biology， Institute of
　　Cotton Research， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Anyang 455000， China; 3. Biotechnology
　　Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）
　　Abstract
　　In order to identify the species and the occurrence of the pathogen which cause cotton wilting and vascular browning， cotton wilting and vascular browning plants collected from 47 main cotton planting areas in Xinjiang were separated and identified. And the isolation method was also improved. The result showed that 358 purified strains were obtained from 20 sites in South Xinjiang， Verticillium dahliae accounting for 81.8%， and Fusarium oxysporum for 18.2%. 495 were obtained from 27 sites in Northern Xinjiang， V.dahliae accounting for 93.9%， and F.oxysporum for 6.1%. Fusarium wilt in South is more serious than that in North Xinjiang. The improved isolation method only needed 2 min and its contamination rate was only 6.7%.
　　Key words
　　cotton; Verticillium wilt; Fusarium wilt; rapid isolation method
　　新疆是我国最大的优质棉生产基地，近年来由于高密度栽培、宽膜覆盖、膜下滴灌等新技术的应用，使得棉花单产、品质等得到大幅度提高，但各种病虫害也逐渐加重，特别是土传病害枯、黄萎病危害尤为明显。
　　棉花枯萎病病原菌为尖镰孢萎蔫专化性Fusarium oxysporum f. sp. vaxinfectum （Atk.） Synder and Hansen，属半知菌亚门镰孢属，该病原菌分布于土壤层60 cm以上且在土壤中可存活6～7年。病菌在浸水条件下容易死亡[12]。该病最早于1891年在美国发现[3]，20世纪70-80年代初期，随棉种的大量调运，该病遍布于全国各主要产棉区，每年因此病损失皮棉约200万担[2]。20世纪80年代中后期，抗病品种开始大量推广，该病在我国主要产棉区得到了控制，但长绒棉枯萎病仍然很严重。陆地棉枯萎病也时有发生，且个别地块特别严重，仍是棉花生产上一个重要的问题[4]。
　　棉花黄萎病是由大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.引起的土传维管束病害，可严重影响棉花的品质和产量，是制约新疆棉花生产的主要障碍之一，发生严重时可导致减产80%[5]。该病原菌可侵染200余种经济作物，是世界性的重大植物病害[67]。大丽轮枝菌的微菌核抵抗不良环境能力强，可以在没有寄主的条件下存活十几年之久[8]，在0～20 cm的土壤中成聚集或均匀分布[9]。棉田中的黄萎病菌是一个混合基因型群体[10]，易于变异，防治困难。在生产上，抗黄萎病育种工作的进展与棉花生产的要求还有很大的差距[11]。棉花枯萎病和黄萎病都属于土传维管束病害，都可产生萎蔫症状，有的同株混发，难以区分。因此，明确新疆棉花维管束病害发生的现状，以及新疆棉花上致病菌的类型對于棉花病害防治具有非常重要的意义。 　　维管束病害分离采用常规组织分离法，该方法耗时费力，因此本研究对其分离方法进行了改进，加速了病原菌分离的速度，为棉花枯、黄萎病后期深入系统研究奠定坚实基础。
　　1 材料和方法
　　1.1 样品采集
　　本课题组于2016年-2017年5月至10月从新疆主要植棉区（包括新疆维吾尔自治区和新疆建设兵团）采集有萎蔫症状的棉花病株，每个地块10～20株并观察记录植株发病症状。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 常规组织分离法和改进方法比较
　　本试验对维管束病害的分离方法进行了改进，并比较改进和常规组织分离方法的优缺点，每种方法检测样品都为30株有萎蔫症状的棉花植株，样品采自145团多年连作的棉花重病田。
　　常规组织分离方法：以5%次氯酸钠作为消毒剂。（1）用修枝剪将棉秆剪成10 cm左右的小段，用75%酒精棉擦拭干凈;（2）在盛有75%乙醇的培养皿中浸泡5 min，然后5%次氯酸钠消毒5 min，75%乙醇再浸泡5 min，无菌水冲洗4遍，灭菌滤纸吸干残余液体，将棉秆剪成0.5 cm左右的小段于灭菌培养皿中，然后用灭菌镊子将小段插在PDA平板上，每平板5个，为防止交叉污染，每分离1个样品，需要换1套器皿;（3）待培养基上的小段棉秆长出菌丝时，用接种环刮取少量菌丝于放有200 μL无菌水的离心管中，振荡摇匀，制成孢子和菌丝悬浮液，用灭菌的接种环蘸取悬浮液在新的PDA平板上划线，于26℃黑暗培养2～3 d;（4）用接种针挑取单菌落接到新的PDA培养基中央，26℃黑暗培养15 d，病原菌长至直径为6 cm的菌落，为纯化菌株。
　　改进方法：（1）用灭菌的修枝剪将两节果枝之间表皮无损伤的棉秆截成10 cm的小段;（2）以下操作在无菌操作台中进行：用75%酒精棉擦棉秆两次，然后捏住棉秆一段，将棉秆剥皮，剥皮时注意不要碰触已经剥皮部分，用灭菌的修枝剪减去头端，然后将剩余剥皮部分剪成0.5 cm左右的小段于灭菌培养皿中，用灭菌镊子将小段棉秆部分埋进培养基，每皿放5个小段，26℃黑暗培养3～4 d，之后步骤同1.2中的（2）和（3）。
　　1.2.2 新疆不同地区棉花病株的分离鉴定
　　采用1.2.1中的改进方法对新疆不同地区的棉花病株进行分离鉴定。
　　1.3 数据处理
　　利用Excel 2007进行数据处理分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 棉花枯、黄萎病田间主要症状
　　棉花枯萎病主要出现在苗期，症状与环境条件有一定关系。新疆早春气温较低，较易出现紫红型，叶片变紫红色或呈紫红色的斑块，以后逐渐萎蔫、枯死、脱落（图1 a）;黄色网纹型子叶或真叶的叶脉局部或全部褪绿，叶肉仍保持绿色，随后逐渐枯死脱落（图1 b）;矮缩型植株矮化，节间缩短，顶叶发生皱缩、畸形（图1 b、c）;黄化型多从叶尖或叶缘开始，局部或全部褪绿变黄，也伴有矮缩现象，随后逐渐变褐枯死或脱落（图1 c、d）。不同症状类型有时同时出现，例如黄色网纹型和矮缩型，黄化型和矮缩型等。剖秆检查，维管束有变褐现象。
　　棉花黄萎病：田间表现最多的为普通型，感病初期叶片叶肉失绿，黄绿相间斑驳成块，叶片挺而不萎;当病害进一步发展，叶肉间出现不规则嵌状病斑，主脉仍保持绿色，病叶向上蜷曲，呈掌状斑驳（“花西瓜皮”状）（图2 a），严重时叶片焦枯（图2 b）。棉花黄萎病在田间的症状有时表现为多数或全株叶片萎蔫下垂，夏季暴雨过后也会出现急性青萎（图2 c），病叶似开水烫伤状萎蔫，后转为褐色枯死，叶片向上蜷曲呈勺状，很快脱落呈光秆（图2 d）。剖秆检查时，维管束都有变褐现象。
　　2.2 新疆棉花枯、黄萎病菌的发生情况
　　2016-2017年每年5月至9月，我们对新疆主要植棉区的陆地棉有萎蔫症状的病株进行分离鉴定，涉及47个植棉县市、团场。分离结果表明，陆地棉主要是黄萎病，但枯萎病也时有发生，个别地块还特别严重。在分离鉴定的911株棉花病株中，853个样品都得到了纯化病原菌株，占总样品的93.6%。枯萎病菌占纯化菌株的11.1%，黄萎病菌占88.9%。南疆涉及20个地点，共检测了391株病株，得到358个纯化菌株，枯萎病菌占18.2%，黄萎病菌占81.8%;北疆涉及27个地点，共检测了520株病株，得到495个纯化菌株，枯萎病菌占6.1%，黄萎病菌占93.9%。从达勒特镇（博尔塔拉蒙古自治州棉花抗病品种选育基地，连续种植棉花30年）和145团（新疆惠远种业病圃地）采集的样品中都可以分离出枯萎病菌和黄萎病菌，说明这两个天然病圃均为枯、黄萎病混发。达勒特镇病圃分离的枯萎病菌占20.0%，黄萎病菌占80.0%;145团惠远病圃地分离的枯萎病菌占30.0%，黄萎病占70.0%。南疆枯萎病发生要比北疆重，且有明显的地域特征，主要集中于农二师29团、30团和31团，所检测的病株均为枯萎病，占南疆枯萎病总检测株数的76.9%;农一师11团和12团枯萎病分别占检测菌株的50.0%和25.0%。具体分离情况见表1。北疆枯萎病零星发生，主要为黄萎病。
　　2.3 棉花枯、黄萎病改进分离方法与常规组织分离方法比较
　　针对枯、黄萎病菌维管束病害分离鉴定速度慢、消毒步骤繁琐、易污染等问题，本试验改进了分离方法。改进方法每分离一个样品只需2 min，30株病株经分离纯化后，除2个皿有杂菌污染外，其余均无污染，污染率6.7%，得到28个纯化菌株，占93.3%（图3 a），实际应用中的纯化率为93.6%（表1），说明该方法准确可靠，实用性强。常规组织分离方法每分离一个样品需要15～20 min，分离的30株病株中，21个皿有其他杂菌污染，污染率70.0%，9个无其他杂菌污染，占30.0%。单孢纯化的菌株有12株，占40.0%（图3 b）;为防止交叉污染，消毒处理时每个样品都要用单独的灭菌容器进行灭菌、无菌水冲洗，无菌滤纸吸干残留的液体，每个样品至少需要8个器皿，而改进方法只需要一个;改进方法所需时间为常规组织分离方法的1/10，纯化率却比常规组织分离方法高53.3百分点，提高了1倍以上。 　　3 讨论
　　3.1 新疆棉花枯、黄萎病发生情况
　　棉花枯萎病一般在苗期或现蕾期出现发病高峰，现蕾期是植株抗病性发生的转折点，前期抗病性较弱，后期抗病性增强[12]。南疆棉花调查时间集中于7月中旬，此时个别条田枯萎病仍然发生严重。从调查结果可以看出，陆地棉枯萎病主要发生于南疆地区，与缪卫国和田逢秀报道的结果一致[13]。枯萎病发生具有明显的地域特征，主要集中于农二师的29团、30团和31团，农一师11团和12团也有发生。1997年以后随着陆地棉抗病品种的引进和本地高抗枯萎病品种的育成，陆地棉的枯萎病基本得到控制[4]，但仍然有零星发生，个别条田发生严重。因此，病原菌可能仍然存活于条田中或种子带菌。随着连年耕作，棉花品种的更换，气候条件的变化，选择压力的增加，病原菌本身发生变异或生理小种优势群体的变化，使得个别条田枯萎病发生严重，该问题仍然值得注意。
　　石河子地区2008年棉花黃萎病发病面积30%以上，比2001年增加了857.8%[14]。刘海洋等[15]对新疆主要棉区黄萎病进行了调查，在调查的79块棉田中，有黄萎病发生的病田占比为87.3%，其中棉花黄萎病发生程度为中度以上病田占比为48.1%，严重发生病田占到24.1%，甚至部分调查棉田棉花黄萎病发病率高达80%（143团）。本研究在检测的911株萎蔫病株中，黄萎病菌占到88.9%，北疆地区更是占到了93.9%，棉花黄萎病仍然是陆地棉上的主要病害，这些病原菌株的致病力、变异情况等还有待进一步研究。
　　从达勒特镇病圃地（博尔塔拉蒙古自治州棉花抗病品种选育基地，连续种植棉花30年）和145团（新疆惠远种业病圃地）采集的样品中都可以分离出枯萎病菌和黄萎病菌。因此，自然条件下的病圃一般为枯、黄萎病混发，但人工病圃也不能完全排除混发的可能。在鉴定一个品种的抗性时，对枯、黄萎病都达到耐或抗的条件，才能评价这个品种是耐病或抗病品种。虽然这样选择出来的品种对两种病害都达到了耐或抗，更接近育种家和种植者的目的，但这种情况可能会淘汰一些高抗或耐一种病害的品种，造成种质资源的流失。
　　3.2 棉花枯、黄萎病菌分离方法
　　棉花苗期主要病害为枯萎病，在棉花现蕾后，棉花发生的枯、黄萎病就难以区分，给调查的准确性带来了一定的挑战，研究人员在调查时因受试验条件及人力限制，基本混在一起调查。本试验通过改进组织分离鉴定方法，极大地缩短了病菌分离时间，同时也减少了繁琐的步骤，分离纯化率非常高，可快速分离鉴定两种病原菌。但改进方法必须是新鲜样品，若不能及时分离可在4℃存放3～4 d。因该方法简单易操作，采样路途遥远时也可在简单的酒精灯火焰无菌环境周围随时对病株进行分离。
　　常规组织分离方法[1618]耗时费力，有时还需要流水冲洗30 min以上。消毒时需无菌器皿繁多，容易混乱。消毒处理后无菌水冲洗，残留液体需要灭菌滤纸吸干，否则影响病原菌的生长。升汞有剧毒，双氧水或次氯酸钠等也都有腐蚀性，因此操作要十分谨慎。但常规组织分离方法可以分离晾干的样品，不能及时分离时可将样品在通风处晾干（避免暴晒或不透气），保存，后期需要时再做分离。因此，如果需要大量采集样品做研究时，两种方法可结合使用，提高工作效率，加快研究速度。
　　本试验采用改进方法分离维管束病害时，采用的新鲜样品，选取表皮没有破损的地方，只用乙醇对表面进行了简单处理，对维管束没有做任何消毒处理，分离的病原菌纯度非常高，很少有其他细菌或真菌污染，说明维管束中内生菌是非常少的。常规组织分离方法采用的也是新鲜样品，但没有做去皮处理，分离的样品纯度都比较低。一是可能消毒不够彻底，表皮一些顽固性微生物仍有存活，或在分离过程中造成了污染。因此采用常规组织分离方法时一定要及时更换消毒和冲洗器皿;二是可能木本类植物内生菌主要存在表皮组织中，维管束中非常少。因此在研究木本类植物内生菌时，可根据需要，选择合适的部位进行分离。此外，可能因为维管束中内生菌非常少，病原菌侵入之后没有竞争压力，没有与之相拮抗的微生物，加之品种抗病性弱时，一旦侵染成功对植物来说就是毁灭性的，这可能也是棉花黄萎病难以防治的原因之一。
　　参考文献
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