金莲花绿变植原体的分子鉴定

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　　摘要 本研究對河北省大面积发生的金莲花绿变病的病原进行检测和鉴定。以金莲花叶片的总DNA为模板，使用植原体16S rDNA和核糖体蛋白（ribosomal protein）基因rp的特异性引物进行PCR扩增，在感病金莲花样品中扩增到植原体的16S rDNA（1 432 bp）片段和rp基因（1 240 bp）片段。序列分析发现，获得的16S rDNA和rp基因片段与洋葱黄化植原体Onion yellows phytoplasma（GenBank登录号：AP006628）的相似度最高，分别为99.9%和99.3%，确定金莲花绿变病的病原为植原体，暂命名为金莲花绿变植原体Trollius chinensis virescence phytoplasma。对金莲花绿变植原体的16S rDNA进行虚拟RFLP分析，发现其酶切图谱与16Sr Ⅰ-B亚组的洋葱黄化植原体的参照图谱完全一致，相似系数1.00。16S rDNA和rp基因的系统发育进化树显示，金莲花绿变植原体与16SrⅠ-B亚组的植原体聚为一支，属于植原体16S rⅠ-B亚组。
　　关键词 金莲花; 绿变病; 植原体; 16S rDNA; 核糖体蛋白; 系统发育进化树
　　中图分类号： S 435.672
　　 文献标识码： A
　　 DOI： 10.16688/j.zwbh.2019460
　　Molecular identification of Trollius chinensis virescence phytoplasma
　　WANG Rong1， CHEN Bingwei1， LI Yong1， LIU Kun1， WANG Tianyou1， 2， DING Wanlong1
　　（1. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing
　　100193， China; 2. College of Traditional Chinese Medicine，Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）
　　Abstract
　　Trollius chinensis virescence disease widely occurred in Hebei province. In this study， the pathogen of this disease was detected and identified. To determine the pathogen of T.chinensis virescence disease， PCR was performed using total DNA extracted from symptomatic and symptomless leaves of T.chinensis， with primers specifically amplifying 16S rDNA and ribosomal protein gene （rp） of phytoplasma. A 16S rDNA fragment of 1 432 bp and a rp fragment of 1 240 bp were amplified from symptomatic samples， while no expected PCR product was obtained from symptomless samples. Sequence analysis showed that 16S rDNA fragment and rp fragment of T.chinensis virescence shared the highest nucleotide identity （99.9% and 99.3%， respectively） with those of Onion yellows phytoplasma （GenBank accession No.AP006628）. Therefore， we confirmed that the pathogen of T.chinensis virescence disease was phytoplasma， tentatively named T.chinensis virescence phytoplasma. The virtual restriction fragment length polymorphism （RFLP） pattern derived from the 16S rDNA fragment of T.chinensis virescence phytoplasma is identical （similarity coefficient 1.00） to the reference pattern of Onion yellow phytoplasma， a representative member of 16Sr group Ⅰ， subgroup B. Phylogenetic analysis showed that 16S rDNA and rp gene of T.chinensis virescence phytoplasma clustered in 16Sr group Ⅰ， subgroup B.
　　Key words
　　Trollius chinensis; virescence disease; phytoplasma; 16S rDNA; ribosomal protein; phylogenetic tree 　　植原体（phytoplasma）是一类不具有细胞壁、由昆虫介体传播的植物病原细菌，可危害1 000多种植物，仅我国报道的就有100多种[13]。植物感染植原体后可表现丛枝（witches’-broom）、黄化（yellowing）、花变叶（phyllody）、衰退（withering）、绿变（virescence）、矮化（stunting）、韧皮部坏死（phloem necrosis）等症状[4]。植原体主要存在于植物韧皮部筛管和介体昆虫体内，很难在体外被培养，主要通过叶蝉、木虱等刺吸式昆虫传播[5]。
　　随着PCR检测、测序和系统进化树分析方法的建立，已建立了根据保守性较高的16S rDNA序列信息对植原体进行分类的规则。2004年，国际比较菌原体学研究计划（IRPCM）为植原体建立了一个暂定属——‘Candidatus （Ca.） Phytoplasma’，目前该属已有38个成员。根据IRPCM规定，当植原体株系与已确定种的16S rDNA序列相似度低于97.5%，即可确定为新种[68]。根据16S rDNA的序列特征和限制性片段长度多态性（RFLP），已将植原体划分为28个组和若干亚组[910]。16S rDNA的高度保守性不利于亲缘关系较近的亚组间划分，研究中常依据核糖体蛋白（rp）基因、延伸因子（tuf）基因、16S～23S 间隔区等核苷酸序列变异较大的区域进行亚组的分类[9]。
　　金莲花Trollius chinensis Bunge是毛茛科Ranunculaceae多年生草本植物，其花色泽艳丽，不仅具有观赏价值，还是一味重要中药，具有“明目、解岚障”之功效[11]。在病害调查时发现河北省沽源县和围场县种植的金莲花出现大面积花绿变病害，严重地块病害发生率可达20%～30%，感病植株表现为花变小，萼片和花瓣均为绿色，不能正常开花。叶片黄化，植株长势变弱（图1），观赏性下降，药材产量降低。根据症状特征推测该病害由植原体侵染引起。本研究采用PCR扩增植原体16S rDNA基因和核糖体蛋白基因（rp），对其16S rDNA序列rp基因序列进行分析，构建系统发育进化树，并利用植原体在线分析软件iPhyClassifier确定其分类和进化地位，旨在為该病害的防控提供理论依据。
　　1 材料和方法
　　1.1 试验材料
　　检测样品：样品为2018年7月在河北省沽源县和围场县金莲花人工种植区采集的具有金莲花绿变病的金莲花叶片。
　　试剂及仪器：CTAB购自Sigma公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;pClone007 Vector Kit购自北京擎科新业生物技术有限公司;Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、大肠杆菌DH-5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
　　1.2 叶片总DNA提取
　　采用CTAB法提取叶片总DNA。将金莲花植株叶片置于液氮中充分研磨，取约0.1 g植物粉末至离心管，加入600 μL 2% CTAB溶液（2% CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，1% PVP，pH 8.0）振荡混匀;置于65℃水浴锅20 min;加入等体积的氯仿抽提，12 000 r/min离心5 min，取上清;加入0.6倍体积的异丙醇，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，沉淀干燥后溶于50 μL ddH2O，置于-20℃保存备用。
　　1.3 PCR检测
　　根据Lee等报道的植原体16S rDNA基因扩增引物R16mF2（5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′）/R16mR1（5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′）和rp基因的扩增引物rpF1（5′-GGACATAAGTTAGGTGAATTT-3′）/rpR1（5′-ACGATATTTAGTTCTTTTTGG-3′）[9， 12]，以表现金莲花绿变症状的植株叶片总DNA为模板进行PCR 扩增，以健康金莲花叶片总DNA样品为阴性对照。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目标条带，并将目标条带克隆到pClone007载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。
　　1.4 序列比对分析
　　使用NCBI网站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTn程序和DNAMAN 6.0软件对所得序列进行比对分析。在GenBank数据库下载获得27个16S rDNA序列，16个rp基因序列，使用MEGA 5.2软件以邻接法（neighbor joining）分别构建16S rDNA和rp基因的系统发育进化树，Bootstrap重复数为1 000。
　　1.5 植原体16S rDNA序列iPhyClassifier在线分析
　　通过植原体的在线分类鉴定软件iPhyClassifier[13]（https：∥plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi）对植原体16S rDNA序列进行分析，确定植原体的分类地位。
　　2 结果和分析
　　2.1 金莲花绿变病症状表现
　　感病金莲花的花变小，萼片和花瓣均为绿色，不能正常开花，叶片黄化，植株长势变弱（图1）。
　　2.2 PCR检测
　　通过PCR的方法，使用植原体16S rDNA基因和rp基因的特异引物R16mF2/R16mR1和 rpF1/rpR1引物在感病金莲花样品中分别扩增到约1.4 kb和约1.2 kb的条带，健康金莲花样品中未扩增到上述条带（图2）。初步确定金莲花绿变病的病原为植原体，暂命名为金莲花绿变植原体Trollius chinensis virescence phytoplasma。 　　2.3 16S rDNA和rp基因片段的克隆及其序列分析
　　经测序分析发现，供试样品16S rDNA片段全长1 432 bp（GenBank登录号：MK880149），包含植原体16S rDNA序列，G+C含量为51.4%。BLASTn分析发现该片段与16Sr Ⅰ组成员洋葱黄化植原体Onion yellows phytoplasma（GenBank登录号：AP006628）的相似度最高，为99.9%，与候选种Ca.P.asteris （GenBank登录号：KX773527）的相似度为99.8%。初步确定金莲花绿变植原体属于16Sr Ⅰ组，与Ca. P.asteris候选种相关。
　　rp基因片段的测序结果显示，该片段长1 240 bp（GenBank登录号：MN027280），包含核糖体蛋白基因L22（rpl22）和S3（rps3）的全部编码区及S19（rps19）的部分编码区。BLASTn分析发现该片段与洋葱黄化植原体的相似度为99.3%。
　　2.4 RFLP分析及系统发育树构建
　　使用iPhyClassifier软件对金莲花绿变植原体16S rDNA 进行虚拟RFLP分析，结果显示其酶切图谱与16Sr Ⅰ-B亚组的洋葱黄化植原体的参照图谱完全一致（相似系数1.00）。此结果确定金莲花绿变植原体属于16Sr Ⅰ-B亚组。
　　根据16S rDNA序列构建的系统发育进化树显示，金莲花绿变植原体与Ca.P.asteris（GenBank登录号：KX773527）、玉米丛矮植原体Maize bushy stunt phytoplasma（GenBank登录号：AY265208）、月见草植原体Oenothera phytoplasma（GenBank登录号：M30790）和洋葱黄化植原体聚为一支，亲缘关系最近，属于16SrⅠ组，B亚组（图3）。根据rp基因序列构建的系统发育进化树显示，金莲花绿变植原体与洋葱黄化植原体和玉米丛矮植原体聚为一支，亲缘关系最近（图4）。此结果进一步确定金莲花绿变植原体属于16Sr Ⅰ-B亚组。
　　3 讨论
　　金莲花是常用中药，民间常用于治疗急、慢性扁桃体炎、中耳炎、上呼吸道感染等症。近年来，金莲花野生資源日益匮乏，多以人工种植为主，随着金莲花的大规模集约化种植，暴露了生产过程中存在的很多问题。2018年，在河北沽源和围场的金莲花产区发现金莲花绿变病，通过PCR扩增植原体16S rDNA和rp基因、序列分析和构建系统发育进化树等分子生物学方法，确定金莲花绿变病的病原为16Sr Ⅰ-B亚组的植原体，该植原体与候选种Ca. P.asteris的16S rDNA序列相似度最高（99.8%），为Ca. P.asteris的相关株系。这是世界范围内首次报道植原体危害金莲花。
　　植原体病害主要以预防为主，一旦病害暴发无有效的防治措施，会造成严重的经济损失。只有明确金莲花绿变植原体的传染源和传播途径才能够有的放矢地对该病害进行防治。基于16S rDNA和rp基因的序列比对分析和系统进化发育树，发现金莲花绿变植原体与洋葱黄化植原体、玉米丛矮植原体和月见草植原体的亲缘关系最近，这暗示了它们之间在生物学方面存在着亲缘关系，但这是否为金莲花绿变病的传染源，还需进一步研究确认。调查发现，金莲花种植区椿象等刺吸式昆虫频繁高发，这些昆虫介体是否为植原体传播的主要媒介，还有待进一步鉴定。
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　　（責任编辑：杨明丽）
　　收稿日期： 20190903   修订日期： 20191120
　　基金项目：中国医学科学院医学与健康科技创新工程 （2016-I2M-3-017）;中央本级重大增减支项目（2060302）
　　致  谢： 参加本试验部分工作的还有江代礼、谭翰杰、张能和纪烨斌等同学，特此一并致谢。
　　通信作者E-mail：wlding@implad.ac.cn
　　#为并列第一作者
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