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基于SSR分子标记的普通丝瓜杂交种子纯度鉴定

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  摘要:为了建立一种高效、准确的普通丝瓜品种纯度检测方法,以普通丝瓜丝盛2号及其亲本为试验材料,利用SSR分子标记技术鉴定杂交种种子纯度,从106对SSR引物中筛选出1对引物(SGSSR4),其在杂交种和双亲之间存在显著差异条带,且杂交种含有父、母本的特异互补带型。利用该引物对26株丝盛2号杂交种进行纯度鉴定,鉴定结果为96.15%,与大田种植鉴定结果一致,表明该引物可用于丝盛2号杂交一代种子纯度的快速检测和准确鉴定。
  关键词:普通丝瓜;ISS分子标记;种子纯度;鉴定
  中图分类号: S642.403.6文献标志码: A
  文章编号:1002-1302(2020)08-0053-03
  收稿日期:2019-04-03
  基金项目:福建省自然科学基金(编号:2019J011112);福建省科技计划项目-省属公益类科研院所基本科研专项(编号:2018R1026-5);福建省农业科学院“青年科技英才百人计划”(编号:YC2017-5);中央引导地方科技发展专项(编号:2018L3005);福建省农业科学院科技创新团队建设项目(编号:STIT2017-1-2);国家大宗蔬菜产业技术体系福州综合试验站项目(编号:CARS-23-G-53)。
  作者简介:朱海生(1978—),男,安徽枞阳人,博士,研究员,主要从事蔬菜生物技术与育种方面的研究。E-mail:zhs0246@163.com。
  丝瓜(Luffa cylindrica)起源于印度,主要分布于温带、热带和亚热带地区,为葫芦科(Cucurbitaceae)丝瓜属(Luffa Mill.)一年生攀缘藤本植物,是我国最主要的瓜类蔬菜之一,在我国各地均有大面积栽培[1]。丝瓜属主要有8个种,普通丝瓜(俗称肉丝瓜)是其中最为重要的栽培种之一,我国大部分地区以栽培普通丝瓜为主[2-3]。普通丝瓜肉质清香软滑,营养价值高,同时具有天然保健及药用价值,深受广大消费者喜爱,其栽培面积和需求量正在不断增大,具有巨大的经济潜力和广阔的应用前景。利用杂种优势,培育一代杂交丝瓜品种是目前普通丝瓜育种的主要方法。由于在普通丝瓜杂交制种过程中,人工去雄不彻底或漏去雄等原因,常会出现假杂交种,导致种子遗传纯度降低,给生产造成巨大的经济损失。因此,杂交种品种纯度和种子真实性准确、简便、快速鉴定成为普通丝瓜生产中最为迫切解决的问题之一。
  分子生物学的迅速发展,使从DNA分子水平上对品种纯度进行基因鉴定和分析成为可能。采用分子标记技术进行种子纯度鉴定是一种快速、便捷、准确、有效的方法。微卫星序列即简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记,广泛存在于真核和原核生物基因组中。SSR分子标记具有重复性好、稳定可靠、位点特异、复等位、呈共显性等优点,已经成为最为广泛的分子标记之一[4-5],也是目前作物品种鉴定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一[6-7]。本研究利用SSR分子标记技术,筛选出特异性SSR引物,建立了一套快速检测普通丝瓜种子纯度的方法,以期为准确快速、简单高效的普通丝瓜杂交种子纯度鑒定提供参考。
  1 材料与方法
  1.1 普通丝瓜转录组测序与SSR分子标记筛选
  普通丝瓜转录组数据来源于笔者所在课题组Illumina高通量深度测序结果。委托基迪奥生物科技有限公司进行RNA-Seq转录组测序,利用Primer 3.0对含SSR位点序列进行引物设计,引物序列长度18~25 bp,扩增产物长度100~280 bp,GC含量40%~60%,退火温度55~65 ℃,随机选择其中20 bp以上SSR序列的150对标记进行合成,进行SSR-PCR扩增以验证其有效性。
  1.2 材料及其DNA提取
  供试材料为普通丝瓜丝盛2号杂交种及其父母本,为福建省农业科学院培育品种。基因组DNA提取采用CTAB法进行[8],选取2~3张嫩叶,加入1~2勺的PVP和液氮,迅速研磨成粉状,移入1.5 mL的离心管后加入600 μL预热至65 ℃的2% CTAB Buffer和7 μL β-巯基乙醇,充分混匀后,65 ℃ 水浴1 h,期间多次摇匀;室温冷却后三氯甲烷等体积的加入三氯甲烷/异戊醇,混匀静置10 min,在 12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min;取上清液,加入100 μL 3 mol/L NaAc和300 μL的三氯甲烷/异戊醇充分混匀,离心10 min;再次取上清液,并加入0.6倍体积异丙醇,混匀至能看到白色絮状物,在 12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min,75%乙醇洗涤DNA 2~3次,风干后的DNA溶于100 μL TE溶液,加入2.5 μL RNase A去除RNA,保存于4 ℃或 -20 ℃ 备用。
  1.3 普通丝瓜杂交种丝盛2号纯度鉴定SSR特异引物的筛选
  以丝盛2号杂交种及其父母本为模板,利用“1.1”节筛选的引物,进行PCR扩增,筛选能区分丝盛2号杂交种及其父母本的特异性引物。
  PCR扩增时采用的反应体系:75 ng基因组DNA 1 μL,0.2 mmol/L dNTP 1 μL,500 u Taq DNA聚合酶0.3 μL,0.4 μmol/L的引物各1 μL,2.5 μL 10×Buffer,加入灭菌的超纯水至25 μL。PCR扩增程序:先在95 ℃预变性5 min;接下来35个循环,每个循环包括94 ℃下变性30 s,56 ℃下退火30 s,72 ℃ 下延伸30 min;最后72 ℃下延伸7 min,反应结束后于4 ℃保存。PCR扩增产物电泳分离后观察拍照分析。
  1.4 普通丝瓜杂交种丝盛2号纯度鉴定
  随机抽取丝盛2号杂交种,利用筛选出来的SSR特异引物进行鉴定,结合田间种植鉴定结果,验证利用SSR分子标记鉴定种子纯度的准确性。只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种,缺少其中的任意一条带记为假杂种,计算种子纯度。   2 结果与分析
  2.1 普通丝瓜DNA提取与鉴定
  应用改良后CTAB法提取的DNA,通过浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果表明:DNA条带清晰,拖带现象不明显,带形集中。D260 nm/D280 nm值在1.8~2.0之间,表示所提取的DNA杂质含量少,纯度较高,适合于做进一步研究(图1)。
  2.2 普通丝瓜SSR分子标记数据来源与筛选
  普通丝瓜转录组经组装后共获得58 073条Unigene,利用MISA工具进行搜索,其中6 916条Unigene序列中含有7 478个SSR位点。对含SSR位点的6 916条Unigene序列利用Primer 3.0设计引物,共设计出SSR引物7 563对。选取长度在 20 bp 以上的SSR序列,合成长度18~25 bp、扩增产物长度100~280 bp的引物150对,进行SSR-PCR扩增有效性检测。SSR-PCR扩增结果表明,106对SSR引物实现有效扩增,且带型清晰、重复性好(图2)。
  2.3 SSR特异引物筛选
  利用筛选出的106对有效扩增SSR引物对丝盛2号杂交种及其父母本进行PCR扩增及特异引物筛选。筛选到共显性标记的引物SGSSR4
  (SGSSR4-F:5′-AGGGGTTAGTCGACCGATTT-3′;SGSSR4-R:5′-TGCTTGCCACTTGAAGAAAC-3′)。引物SGSSR4能同时产生父本和母本特异性标记,并在丝盛2号杂交种中扩增出互补条带(图3),表明该对引物可用于丝盛2号种子纯度的检测。
  2.3 杂交种纯度鉴定
  从田间随机选取26株丝盛2号普通丝瓜,利用筛选得到的特异性引物对SGSSR4进行纯度检测,PCR扩增结果表明,25株能清晰地扩增出与亲本互补的条带,扩增出父本特异条带各1株(图4),种子纯度为96.15%,与田间检测结果一致。
  3 讨论与结论
  近些年随着分子标记技术的深入研究,使得分子标记技术成为鉴定普通丝瓜种子纯度的快速、准确的方法。基于转录组的SSR分子标记较一般的分子标记具有信息量大、通用性好、在基因组序列中分布广泛等优势,在杂交种的鉴定和种子纯度检测方面具有很大优越性,已在多种植物中广泛应用[9-10]。现有的普通丝瓜SSR分子標记数量有限,
  大量开发SSR标记仍是目前普通丝瓜研究的重要工作之一。本研究利用普通丝瓜转录组测序获得的SSR标记,筛选出能有效扩增,且带型清晰、重复性好的SSR引物,为后期普通丝瓜杂交种子纯度鉴定提供了参考。
  鉴于采用传统的田间性状鉴定技术鉴定种子纯度周期长、成本高、工作量大,且以播种后植株的田间形态观察为依据,易受外界环境和检测人员水平等因素影响,导致结果存在偏差[11]。SSR分子标记技术直接反映不同品种的遗传基础差异,为植物品种种子纯度鉴定提供了一种更准确、快速、简便、高效的方法。SSR标记数量多,具有很高多态性,带型易于区分判断,能区分纯合基因型和杂合基因型,是一项很有潜力的技术,在黄瓜[12]、青花菜[13]、甘蓝[14]等蔬菜中都有相关报道,但是利用SSR分子标记技术鉴定品种种子纯度时,前提条件是能够准确筛选出能在双亲中清晰、特异扩增的条带。本研究从106对引物中筛选出1条特异性强的引物SGSSR4,引物SGSSR4能同时产生父本和母本特异性标记,可将普通丝瓜杂交种子与其父母本区分开来,快速检测出杂交种子的纯度,具有准确、低成本、操作方便等优势,能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法,具有较高的商业应用价值,为普通丝瓜种子质量控制和纯度鉴定提供了参考依据。
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