基于SSR分子标记的普通丝瓜杂交种子纯度鉴定

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　　摘要：为了建立一种高效、准确的普通丝瓜品种纯度检测方法，以普通丝瓜丝盛2号及其亲本为试验材料，利用SSR分子标记技术鉴定杂交种种子纯度，从106对SSR引物中筛选出1对引物（SGSSR4），其在杂交种和双亲之间存在显著差异条带，且杂交种含有父、母本的特异互补带型。利用该引物对26株丝盛2号杂交种进行纯度鉴定，鉴定结果为96.15%，与大田种植鉴定结果一致，表明该引物可用于丝盛2号杂交一代种子纯度的快速检测和准确鉴定。
　　关键词：普通丝瓜;ISS分子标记;种子纯度;鉴定
　　中图分类号： S642.403.6文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）08-0053-03
　　收稿日期：2019-04-03
　　基金项目：福建省自然科学基金（编号：2019J011112）;福建省科技计划项目-省属公益类科研院所基本科研专项（编号：2018R1026-5）;福建省农业科学院“青年科技英才百人计划”（编号：YC2017-5）;中央引导地方科技发展专项（编号：2018L3005）;福建省农业科学院科技创新团队建设项目（编号：STIT2017-1-2）;国家大宗蔬菜产业技术体系福州综合试验站项目（编号：CARS-23-G-53）。
　　作者简介：朱海生（1978—），男，安徽枞阳人，博士，研究员，主要从事蔬菜生物技术与育种方面的研究。E-mail：zhs0246@163.com。
　　丝瓜（Luffa cylindrica）起源于印度，主要分布于温带、热带和亚热带地区，为葫芦科（Cucurbitaceae）丝瓜属（Luffa Mill.）一年生攀缘藤本植物，是我国最主要的瓜类蔬菜之一，在我国各地均有大面积栽培[1]。丝瓜属主要有8个种，普通丝瓜（俗称肉丝瓜）是其中最为重要的栽培种之一，我国大部分地区以栽培普通丝瓜为主[2-3]。普通丝瓜肉质清香软滑，营养价值高，同时具有天然保健及药用价值，深受广大消费者喜爱，其栽培面积和需求量正在不断增大，具有巨大的经济潜力和广阔的应用前景。利用杂种优势，培育一代杂交丝瓜品种是目前普通丝瓜育种的主要方法。由于在普通丝瓜杂交制种过程中，人工去雄不彻底或漏去雄等原因，常会出现假杂交种，导致种子遗传纯度降低，给生产造成巨大的经济损失。因此，杂交种品种纯度和种子真实性准确、简便、快速鉴定成为普通丝瓜生产中最为迫切解决的问题之一。
　　分子生物学的迅速发展，使从DNA分子水平上对品种纯度进行基因鉴定和分析成为可能。采用分子标记技术进行种子纯度鉴定是一种快速、便捷、准确、有效的方法。微卫星序列即简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）分子标记，广泛存在于真核和原核生物基因组中。SSR分子标记具有重复性好、稳定可靠、位点特异、复等位、呈共显性等优点，已经成为最为广泛的分子标记之一[4-5]，也是目前作物品种鉴定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一[6-7]。本研究利用SSR分子标记技术，筛选出特异性SSR引物，建立了一套快速检测普通丝瓜种子纯度的方法，以期为准确快速、简单高效的普通丝瓜杂交种子纯度鑒定提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 普通丝瓜转录组测序与SSR分子标记筛选
　　普通丝瓜转录组数据来源于笔者所在课题组Illumina高通量深度测序结果。委托基迪奥生物科技有限公司进行RNA-Seq转录组测序，利用Primer 3.0对含SSR位点序列进行引物设计，引物序列长度18～25 bp，扩增产物长度100～280 bp，GC含量40%～60%，退火温度55～65 ℃，随机选择其中20 bp以上SSR序列的150对标记进行合成，进行SSR-PCR扩增以验证其有效性。
　　1.2 材料及其DNA提取
　　供试材料为普通丝瓜丝盛2号杂交种及其父母本，为福建省农业科学院培育品种。基因组DNA提取采用CTAB法进行[8]，选取2～3张嫩叶，加入1～2勺的PVP和液氮，迅速研磨成粉状，移入1.5 mL的离心管后加入600 μL预热至65 ℃的2% CTAB Buffer和7 μL β-巯基乙醇，充分混匀后，65 ℃ 水浴1 h，期间多次摇匀;室温冷却后三氯甲烷等体积的加入三氯甲烷/异戊醇，混匀静置10 min，在 12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min;取上清液，加入100 μL 3 mol/L NaAc和300 μL的三氯甲烷/异戊醇充分混匀，离心10 min;再次取上清液，并加入0.6倍体积异丙醇，混匀至能看到白色絮状物，在 12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，75%乙醇洗涤DNA 2～3次，风干后的DNA溶于100 μL TE溶液，加入2.5 μL RNase A去除RNA，保存于4 ℃或 -20 ℃ 备用。
　　1.3 普通丝瓜杂交种丝盛2号纯度鉴定SSR特异引物的筛选
　　以丝盛2号杂交种及其父母本为模板，利用“1.1”节筛选的引物，进行PCR扩增，筛选能区分丝盛2号杂交种及其父母本的特异性引物。
　　PCR扩增时采用的反应体系：75 ng基因组DNA 1 μL，0.2 mmol/L dNTP 1 μL，500 u Taq DNA聚合酶0.3 μL，0.4 μmol/L的引物各1 μL，2.5 μL 10×Buffer，加入灭菌的超纯水至25 μL。PCR扩增程序：先在95 ℃预变性5 min;接下来35个循环，每个循环包括94 ℃下变性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃ 下延伸30 min;最后72 ℃下延伸7 min，反应结束后于4 ℃保存。PCR扩增产物电泳分离后观察拍照分析。
　　1.4 普通丝瓜杂交种丝盛2号纯度鉴定
　　随机抽取丝盛2号杂交种，利用筛选出来的SSR特异引物进行鉴定，结合田间种植鉴定结果，验证利用SSR分子标记鉴定种子纯度的准确性。只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度。 　　2 结果与分析
　　2.1 普通丝瓜DNA提取与鉴定
　　应用改良后CTAB法提取的DNA，通过浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：DNA条带清晰，拖带现象不明显，带形集中。D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之间，表示所提取的DNA杂质含量少，纯度较高，适合于做进一步研究（图1）。
　　2.2 普通丝瓜SSR分子标记数据来源与筛选
　　普通丝瓜转录组经组装后共获得58 073条Unigene，利用MISA工具进行搜索，其中6 916条Unigene序列中含有7 478个SSR位点。对含SSR位点的6 916条Unigene序列利用Primer 3.0设计引物，共设计出SSR引物7 563对。选取长度在 20 bp 以上的SSR序列，合成长度18～25 bp、扩增产物长度100～280 bp的引物150对，进行SSR-PCR扩增有效性检测。SSR-PCR扩增结果表明，106对SSR引物实现有效扩增，且带型清晰、重复性好（图2）。
　　2.3 SSR特异引物筛选
　　利用筛选出的106对有效扩增SSR引物对丝盛2号杂交种及其父母本进行PCR扩增及特异引物筛选。筛选到共显性标记的引物SGSSR4
　　（SGSSR4-F：5′-AGGGGTTAGTCGACCGATTT-3′;SGSSR4-R：5′-TGCTTGCCACTTGAAGAAAC-3′）。引物SGSSR4能同时产生父本和母本特异性标记，并在丝盛2号杂交种中扩增出互补条带（图3），表明该对引物可用于丝盛2号种子纯度的检测。
　　2.3 杂交种纯度鉴定
　　从田间随机选取26株丝盛2号普通丝瓜，利用筛选得到的特异性引物对SGSSR4进行纯度检测，PCR扩增结果表明，25株能清晰地扩增出与亲本互补的条带，扩增出父本特异条带各1株（图4），种子纯度为96.15%，与田间检测结果一致。
　　3 讨论与结论
　　近些年随着分子标记技术的深入研究，使得分子标记技术成为鉴定普通丝瓜种子纯度的快速、准确的方法。基于转录组的SSR分子标记较一般的分子标记具有信息量大、通用性好、在基因组序列中分布广泛等优势，在杂交种的鉴定和种子纯度检测方面具有很大优越性，已在多种植物中广泛应用[9-10]。现有的普通丝瓜SSR分子標记数量有限，
　　大量开发SSR标记仍是目前普通丝瓜研究的重要工作之一。本研究利用普通丝瓜转录组测序获得的SSR标记，筛选出能有效扩增，且带型清晰、重复性好的SSR引物，为后期普通丝瓜杂交种子纯度鉴定提供了参考。
　　鉴于采用传统的田间性状鉴定技术鉴定种子纯度周期长、成本高、工作量大，且以播种后植株的田间形态观察为依据，易受外界环境和检测人员水平等因素影响，导致结果存在偏差[11]。SSR分子标记技术直接反映不同品种的遗传基础差异，为植物品种种子纯度鉴定提供了一种更准确、快速、简便、高效的方法。SSR标记数量多，具有很高多态性，带型易于区分判断，能区分纯合基因型和杂合基因型，是一项很有潜力的技术，在黄瓜[12]、青花菜[13]、甘蓝[14]等蔬菜中都有相关报道，但是利用SSR分子标记技术鉴定品种种子纯度时，前提条件是能够准确筛选出能在双亲中清晰、特异扩增的条带。本研究从106对引物中筛选出1条特异性强的引物SGSSR4，引物SGSSR4能同时产生父本和母本特异性标记，可将普通丝瓜杂交种子与其父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度，具有准确、低成本、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值，为普通丝瓜种子质量控制和纯度鉴定提供了参考依据。
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