基于SSR标记的油桃品种需冷性分析

来源:用户上传      作者:史芳芳 梁武军 张延磊

　　摘要 [目的]利用已發表的桃SSR引物分析桃品种资源圃油桃遗传多样性，以期为油桃育种和反季节栽培研究提供参考。[方法]利用24对SSR引物分别对27个油桃品种进行PCR扩增，筛选出多态性好、稳定性高的引物对27个油桃品种进行毛细管电泳分析，并采用遗传相似系数对扩增结果进行分析。[结果]从合成的24对SSR引物中筛选出5对条带清晰、具有多态性的引物，利用聚类分析软件，将油桃分成两大类，第一大类包括23个栽培种，其遗传系数在0.9以上，第二大类包括4个原始种，其遗传系数在0.75～0.85，同时鉴别出2个同物异名的栽培种质资源。[结论]基于文献中发表的SSR桃引物筛选出多态性较好的引物可用于油桃SSR分析。毛细管电泳可以将扩增条带分离至1 bp，能更好地区分种内差异。27个油桃品种有2个原始品种，即台农甜蜜和黑油皇后，与23个栽培品种亲缘关系较远，可以作为母本进行杂交育种，且可以作为需冷性品种候选种质。
　　关键词 油桃;SSR;亲缘关系;种质资源
　　中图分类号 S662.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）07-0059-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.019
　　SSR Analysis on Required Cooling of Nectarin Cultivated Varieties
　　SHI Fangfang， LIANG Wujun，ZHANG Yanlei
　　（Institute of Agricultural Sciences of the 12th Division of Xinjiang Production and Construction Corps， Urumqi，Xinjiang  830088）
　　Abstract [Objective] To provide reference for nectarine breeding and offseason cultivation，the genetic diversity of nectarine in peach variety resource nursery was analyzed by using published peach SSR primers. [Method] 27 nectarine varieties were amplified by PCR with 24 pairs of SSR primers. 27 nectarine varieties were analyzed by capillary electrophoresis with the good polymorphism and high stability primers， and the amplification results were analyzed by genetic similarity coefficient.[Result] Five pairs of primers with clear bands and polymorphism were selected from 24 pairs of SSR primers.Nectarine was divided into two categories， the first of which included 23 cultivated species，in which the genetic coefficient of cultivated species was above 0.9.The second group consisted of 4 original species，that of original species was between 075 and 0.85，meanwhile it could clearly identify the synonyms of two germplasm resources.[Conclusion] Based on the SSR peach primers published in the literature， the primers with good polymorphism could be used for SSR analysis of nectarine. Capillary electrophoresis could isolate the amplified bands to 1bp. There were two original species of 27 nectarine varieties， namely Tainong sweet and black oil queen， which were not closely related to 23 cultivated varieties and could be used as female parents to cross breeding，and can be used as a candidate germplasm for required cooling research. 　　Key words Nectarine;SSR;Genetic relationship;Germplasm resources
　　基金项目 十二师农业科技攻关项目“果树种质资源引种与省力高效标准化栽培示范”（SR2016024）;十二师农业科技攻关项目“盆栽桃规模化生产关键技术研究与示范”（SR2017015）。
　　作者简介 史芳芳（1977—），女，山东潍坊人，高级农艺师，硕士，从事农作物育种及农业科研推广工作。通信作者，高级农艺师，从事农业科研推广工作。
　　收稿日期 2019-09-04
　　目前，很多基层科研单位在开展桃品种的引种筛选试验研究，一方面进行品种适应性观察试验，另一方面为今后开展桃品种杂交试验提供较为丰富的种质，但多数单位仅从果实性状调查、植株长势等农艺性状方面进行判断，或从形态学方面对品种进行分类，因此对于一些种间的杂种进行归类十分困难[1]，致使调查、评价筛选不足[2]。随着研究水平的深入，对种质资源的遗传评价已上升到分子水平[3]，调查本区域内资源圃中油桃的亲缘关系对种质资源的遗传评价及今后开展育种工作具有重要意义。桃种质资源收集、利用、评价是桃育种创新的基础[4]。桃的种质资源分析多集中在对本地区内的桃品种进行遗传评价[5-6]，而对具有丰富地域性的引进品种进行遗传分析的较少。笔者利用已公布的SSR分子标记，对收集保存于新疆第十二师农科所果树资源圃，来源于全国南北方各地品种或品系27份油桃种质，包括栽培品种（系）、原始种质进行遗传分析，从DNA水平评估遗传多样性，并进一步探究引进的原始种质与栽培品种间的亲缘关系，为今后的遗传育种提供可靠的遗传背景信息。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　油桃种质资源共27份，均来自于新疆兵团第十二师农业科学研究所桃资源圃，包括原始种和栽培种。供试材料信息见表1。
　　1.2 SSR扩增
　　利用上海生工工程有限公司植物提取试剂盒进行DNA提取，从已发表的SSR引物[7-10]中筛选出能在27份样本间稳定扩增、多态性好的5对蔷薇类SSR引物（表2）用于遗传分析。反应体系20 μL，扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃预变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30次循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。扩增结束后，加入微量上样缓冲液混匀，5 μL扩增产物琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1×TAE，150 V稳压电泳20 min。电泳结束后凝胶成像系统紫外成像观察扩增效果和多态性。将扩增产物寄到杭州奥盛仪器有限公司进行毛细管电泳SSR分析。
　　1.3 统计分析
　　选取扩增清晰的条带，在相同迁移位置，有条带记为“1”，无条带记为“0”，不同引物扩增的结果构成原始的“0，1”二元数据矩阵。将矩阵用NTSYSPC软件进行数据分析，相似性数据采用Dice系数，选用UPGMA法进行聚类分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 SSR扩增结果及多态性引物筛选
　　将供试的27份油桃品种或品系用不同的SSR引物进行扩增，经过毛细管电泳后以条带多态性为标准，从合成的24对SSR引物中筛选出5对条带清晰、具有多态性的引物（表2）。这些引物共扩增出
　　54条DNA片段，具有多态性片段15条，占比28%，平均每个引物11.2条，最多15条，最少7条，扩增片段的长度多数集中在100～300 bp，图1为引物CPPCT002扩增的情况，小于100 bp条带不计作有效带，因此，此引物有效扩增条带为5条，即141、127、135、156、163 bp。
　　2.2 遗传多样性及系统进化分析 依据聚类分析。27份油桃种质可划分为2个类群（图2），23个品种（系）归为第一大类，属于栽培种，遗传距离在0.9以上，其中，郑4-24与旭日遗传距离为0，相似系数为1，可能是品种的地区交叉传播产生的同物异名现象。其余4个品种（系）归为第二大类，属于原始品种，在遗传距离为0.87处，金海霞与短枝油桃聚在一起，0.77处台农甜蜜单独一类，0.75处黑油皇后也单独一类。总体聚类表明，栽培品种间存在较低的遗传变异，遗传背景相近。原始品种遗传变异较栽培种高，遗传背景与栽培种较远，其中，地方品种黑油皇后与其他栽培种品种遗传距离最远。
　　从相似性矩阵（图3）可以看出，黑油皇后与其他品种相似系数在0.59～0.81，台农甜蜜相似系数在0.59～083，短枝油桃相似系数在0.66～0.87，金海霞相似系数在0.72～090。結合聚类分析结果，黑油皇后可作为资源圃中与其他栽培种油桃杂交的最佳母本。
　　3 讨论
　　3.1 SSR技术中应用毛细管电泳的优势
　　SSR技术已被广泛用于物种亲缘关系分析，但目前，很多科研单位和大学为了节约成本或者大规模进行SSR筛选试验仍在使用琼脂糖凝胶或者聚丙烯酰胺电泳，二者的分辨率很低，特别是琼脂糖凝胶电泳只能进行初筛，而且聚丙烯酰胺电泳试剂配制过程复杂，电泳时间长，需要染色、脱色等步骤，即便跑出条带，有时会因为某个环节出现问题，导致最终电泳条带显示不明显，或者没有拉开条带距离，不能将差异大小小于10 bp的基因片段分离开，条带特异性表现不充分。
　　毛细管电泳原理基于微流体技术，分辨率可以达到 1 bp。与传统毛细管电泳相比，毛细管电泳所需样品量低于1 μL，检测灵敏度能够达到 5 pg/μL，样品分析时间可短至几十秒，而且分离检测过程全部由仪器自动来完成，无人工介入，无交叉污染。与传统电泳相比，毛细管电泳可用的引物范围较广，适用于绝大多数SSR引物，因此试验成本更经济。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，毛细管电泳根据峰值获得的数值化数据更精确，后期数据分析更简便，操作过程简单，且通量高，全程无毒无害[11]。 　　该研究选用桃资源圃27份油桃资源作为试验材料，采用 SSR 分析技术结合毛细管电泳检测技术，筛选出适用于鉴定该试验的油桃SSR引物5对，建立了一套简单、经济、高效的油桃品种（品系）亲缘关系鉴定方法，为完善桃品种快速鉴定方法提供参考。
　　3.2 需冷量不同油桃筛选
　　新疆冬季时间比较漫长，种植的桃树一般开花期和结果期均较内地晚，桃树需冷量较高，但目前已有科研单位研究通过引进需冷量低的设施品种进行反季节栽培，达到提早上市。基于此，通过油桃SSR分析，结合物候期观察试图将低需冷量油桃品种（品系）与较高需冷量油桃品种（品系）分离开，便于筛选出适合于设施反季节栽培品种，并为今后开展桃品种杂交育种試验提供参考。该研究将已知需冷量低的品种台农甜蜜作为目标筛选品种，通过SSR分子标记分析，筛选出与台农甜蜜遗传系数接近的品种（品系）作为需冷量低的候选品种（品系），后期对初筛品种重点开展物候期观察，最终确定反季节栽培品种。该研究结果表明黑油皇后、短枝油桃和金海霞品种与台农甜蜜遗传系数更为接近，可以作为今后研究重点。
　　参考文献
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