盐酸大观霉素高效液相色谱检测方法的建立

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　　摘要 [目的]建立一种简便快捷且稳定经济的盐酸大观霉素高效液相色谱检测方法。[方法]选用C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为乙腈-四氢呋喃-水（35∶35∶30），检测波长415 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量20 μL的高效液相色谱条件，研究该条件下检测样品含量的可行性，并与国家兽药典中的抗生素微生物检定法（管碟法）的检测结果进行对比。[结果]盐酸大观霉素浓度在100 ～900 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系，回收率为99.6%，批内变异系数为0.55%，稳定性良好。同一样品2种方法的检测结果相对偏差为0.42%，符合有关规定。[结论]该试验使用的高效液相色谱法（HPLC）较抗生素微生物检定法操作简便且准确度和稳定性更高。
　　关键词 盐酸大观霉素;高效液相色谱法;含量测定;管碟法
　　中图分类号 R927.2  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）19-0198-05
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.052
　　Abstract [Objective] To establish a simple， rapid， stable and economical high performance liquid chromatography method for the detection of spectinomycin hydrochloride.[Method] C18 chromatographic column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） was selected; mobile phase： acetonitriletetrahydrofuranwater （35∶35∶30）， detection wavelength 415 nm， column temperature 30 ℃， flow rate 1 mL/min， and high performance liquid phase color 20 μL.The feasibility of measuring the sample content by this method was studied， and the results were compared with the test results of the antibiotic microorganism assay （cupplate method） in the National Veterinary Pharmacopoeia. [Result] The concentration of spectinomycin hydrochloride at 100-900 μg/mL showed a good linear relationship with the peak area， the recovery rate was 99.6%， the intra batch variation coefficient was 0.55%， and the stability was good. The relative deviation of the results of the two methods of the same sample was 0.42%， which was in conformity with the relevant regulations. [Conclusion]The high performance liquid chromatography （HPLC） used in this experiment is simpler， more accurate and more stable than the antibiotic microbiological assay.
　　Key words Spectinomycin hydrochloride;High performance liquid chromatography;Content determination;Cupplate method
　　作者簡介 王丽霞（1982—），女，河北唐山人，兽医师，硕士，从事兽医药理学与毒理学研究。
　　收稿日期 2020-07-14
　　大观霉素（spectinomycin）又称壮观菌素，属于氨基糖苷类抗生素，是美国科研机构于1960年从大观链霉菌中提取得到的。由于大观霉素对动物体的毒副作用较小且在动物体内残留甚微，因此成为兽医及养殖户用药的首选药物之一。大观霉素常以盐酸盐或硫酸盐的形式被使用，两者均为白色或者类白色的粉状物，易溶于水，极微溶于乙醇。大观霉素分子式为C14H25ClN2O7，分子量为368.810 5 Da。抗菌谱较广，可用于治疗大部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的疾病，对支原体感染也有一定的治疗效果。其中，大观霉素对淋病奈瑟菌有高度的抗菌活性，对许多肠杆菌科细菌具有中度抗菌活性，而其对沙眼衣原体和梅毒螺旋体无活性。大观霉素是通过与细菌核糖体30S亚单位结合，从而抑制细菌蛋白质的合成以发挥抗菌的作用[1]。
　　目前兽药典载录的大观霉素的主要剂型有盐酸大观霉素注射液和盐酸林可大观霉素可溶性粉。盐酸大观霉素注射液常用于治疗淋病奈瑟菌所致的前列腺炎、尿道炎、宫颈炎和直肠感染，其中治疗对四环素和青霉素耐药的菌株引起的感染效果更佳;盐酸大观林可霉素可溶性粉主要用于畜牧养殖业方面，用于治疗和预防鸭疫巴氏杆菌、鸭霍乱、沙门氏菌和大肠杆菌等细菌性疾病。目前，国内畜牧业对于大观霉素的需求量非常大，因此各科研机构在不断地进行盐酸大观霉素临床使用新剂型的研究，而大观霉素的含量测定是中间必不可少的一个环节。大观霉素具有极性强且无特征性紫外吸收基团的特点，紫外最大吸收波长在190 nm附近，属于末端吸收区[2]，含量分析比较困难。目前已经研究出的大观霉素含量测定方法有气相色谱法[3-4]、高效液相色谱-串联质谱法[5-6]、高效液相色谱-电化学检测法[7-8]、高效液相色谱-蒸发光散射检测法[9-10] 、薄层色谱法[11]、高效液相色谱荧光法[12]和国家兽药典中的抗生素微生物检定法[13]等。其中的一些方法对仪器要求很高，缺乏特异性。在用于企业对产品的质量监控时，太过耗费成本且过程繁复。因此，极需寻找操作简便、实用经济且检测效果可信度高的方法。该试验主要采用HPLC法对盐酸大观霉素含量进行测定，HPLC法的优势在于检测周期短、操作简便快捷、经济实用。而且在该试验中会将HPLC法的试验结果与国家兽药典中的抗生素微生物检定法（管碟法）的标准结果进行比较，以验证HPLC法结果的可靠性。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 药物。
　　肺炎克雷伯标准菌种[CMCC（B）46 117]，购于广东环凯微生物科技有限公司;大观霉素标准品，购于中国兽医药品监察所;盐酸大观霉素原料，购于浙江康恩贝集团。
　　1.1.2 主要化学试剂。
　　抗生素检定培养基Ⅱ号（高pH），购于青岛高科园海博生物技术有限公司;
　　营养肉汤培养基和营养琼脂培养基，购于杭州生物试剂有限公司;
　　磷酸二氢钾，购于天津市凯通化学试剂有限公司;
　　2，4-二硝基苯肼、三氟乙酸、乙腈，购于国药集团化学试剂有限公司;
　　四氢呋喃，购于宿州化学试剂厂;
　　丙酮，购于天津市致远化学试剂有限公司;
　　无水葡萄糖，安徽华澳生物技术有限公司自购;
　　氢氧化钠，购于上海润捷化学试剂有限公司。
　　1.1.3 主要仪器。
　　电热恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;
　　大容量电动移液器（上海泰坦科技股份有限公司）;
　　电子分析天平（美国梅特勒-托利多科学仪器有限公司）;
　　水浴锅（常州市华普达仪器制造厂）;
　　手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司，型号YX280B）;
　　电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）;
　　多功能微生物自动测量分析仪（北京先驱威锋技术开发公司，型号ZY-300IV）;
　　数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号KQ3200DB）;
　　高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）。
　　1.2 主要试剂配制
　　1.2.1 磷酸盐缓冲液（pH=7.0）。
　　称定磷酸二氢钾2.72 g，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液116.4 mL，用纯水稀释定容至400 mL。
　　1.2.2
　　细菌培养基。
　　称定抗生素检定培养基Ⅱ号（高pH）26.55 g，加热搅拌溶解于900 mL蒸馏水中备用。
　　1.2.3
　　大观霉素标准溶液。
　　精密称定大观霉素标准品37.99 mg，用磷酸盐缓冲液（pH=7.0）溶于25 mL容量瓶中，并稀释至刻度线;分别移取5 mL至50 mL（S2）和100 mL（S1）容量瓶中，用磷酸盐缓冲液（pH=7.0）分别将其定容至容量瓶刻度线处。
　　1.2.4
　　盐酸大观霉素样品溶液。
　　精密称定盐酸大观霉素原料药64.18 mg，用磷酸盐缓冲液（pH=7.0）溶于50 mL容量瓶中，并稀释至刻度线;分别移取5 mL至50 mL（T2）和100 mL（T1）容量瓶中，用磷酸盐缓冲液（pH=7.0）分别将其定容至容量瓶刻度线处。
　　1.2.5
　　流动相。
　　以乙腈∶四氫呋喃∶水（35∶35∶30）为流动相，按试验实际需要量进行配制。
　　1.2.6
　　衍生试剂。
　　称定三氟乙酸9.12 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度线。
　　称定2，4-二硝基苯肼0.50 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度线。
　　1.2.7
　　大观霉素标准溶液。
　　精密称定大观霉素标准品12.50 mg于25 mL容量瓶中，用纯水完全溶解，稀释至刻度，现配现用。
　　1.3 抗生素微生物检定法（管碟法）
　　1.3.1 灭菌。
　　1.3.1.1
　　高压灭菌。培养皿、培养基、磷酸盐缓冲液（pH=7.0）、牛津杯等，121 ℃高压灭菌30 min。
　　1.3.1.2
　　高温灭菌。陶瓷瓦片、20 mL刻度吸管在烘箱中140 ℃干热灭菌1 h。
　　1.3.1.3
　　紫外灯灭菌。微生物室、温度计、移液器、大容量电动移液器、钢管放置器等紫外灯灭菌30 min。
　　1.3.2 操作步骤。
　　①取肺炎克雷伯菌[CMCC（B）46 117]接种于营养琼脂斜面上，在37 ℃培养20～22 h，然后将培养好的菌接种于营养肉汤中制备成菌液，保存备用。
　　②将36个培养皿放置在工作台上，使用刻度吸管精密量取20 mL培养基于培养皿中，轻轻摇晃铺平（不能有气泡）。
　　③用1 mL移液器移取0.6 mL菌液于灭菌过的180 mL培养基中（培养基温度50 ℃）。
　　④待培养基冷却凝固后，再移取5 mL含有菌液的培养基铺于其上，铺平（不能有气泡）。
　　⑤将牛津杯放入钢管放置器，待培养基再次冷却凝固后，将培养皿放置在钢管放置器下放入牛津杯（4个）。
　　⑥向牛津杯中加入大观霉素标准品溶液和大观霉素样品溶液，按标准顺序每个牛津杯加入270 μL药液。
　　⑦每个样品做一个平行，每个平行做6个重复。
　　⑧盖上陶瓷瓦片，放入电热恒温培养箱中，37 ℃下培养16～18 h。
　　⑨培养好后取出放入ZY-300IV多功能微生物自动测量分析仪进行效价分析。
　　1.4 高效液相色谱法
　　1.4.1 色谱条件。
　　色谱柱为安捷伦C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈∶四氢呋喃∶水（35∶35∶30），柱温30 ℃，检测波长415 nm，流速1 mL/min，进样量20 μL。
　　1.4.2 线性关系考察。 　　精密称定大观霉素标准品12.50 mg于25 mL容量瓶中，用纯水完全溶解，稀释至刻度。分别准确量取1、3、5、7、9 mL标准曲线储备液于10 mL容量瓶中，用纯水稀释至刻度，摇匀;各吸取0.5 mL于5 mL离心管中，分别加入2 mL三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液和2 mL 2，4-二硝基苯肼（DNPH）-乙腈溶液，将其置于旋涡振荡器上充分振荡，然后置于恒温水浴锅中于70 ℃下进行衍生化反应60 min，衍生化反应结束后放置于冰水中，待冷却后加入丙酮0.5 mL以终止反应，再次充分振荡，继续置于恒温水浴锅中于70 ℃下加热10 min，取出后在室温下自然冷却，于11 000 r/min离心10 min，过膜后利用高效液相色谱进行检测，以大观霉素色谱峰面积与相应的药物浓度绘制标准曲线，得出线性回归方程。
　　1.4.3 回收率试验。
　　以无水葡萄糖为空白辅料，分别向其中加入大观霉素标准品，制成标示量80%、100%、120% 3个已知浓度样品，按照“1.4.2”项下衍生方法对每个样品进行处理，利用HPLC对其进行含量检测，代入以下公式计算每个样品的回收率，即回收率=实际百分含量/理论百分含量×100%。
　　1.4.4 精密度试验。
　　按照标准曲线制备液的方法配制100、500和900 μg/mL 3种不同浓度的大观霉素标准品溶液各3份，按照“1.4.2”项下衍生方法对每个样品进行处理，利用HPLC对其进行含量检测，每个样品连续检测3次，将试验结果代入以下公式并计算3组样品的批内变异系数，变异系数=（标准偏差/平均值）×100%。
　　1.4.5 稳定性试验。
　　按照标准曲线制备液的方法配制300 μg/mL的大观霉素标准品溶液，按照“1.4.2”项下衍生方法对样品进行处理，过膜后利用HPLC对分别放置0、3、6 h的样品溶液进行含量检测，以峰面积计算大观霉素的RSD。
　　1.4.6 杂质干扰试验。
　　取空白原料药（仅含辅料无水葡萄糖），按照“1.4.2”项下衍生方法对样品进行处理，过膜后利用HPLC进行检测，观察在对照品出峰的相应时间内空白辅料有无峰面积。
　　1.4.7 含量测定。
　　 精密称定盐酸大观霉素原料12.50 mg于25 mL容量瓶中，用纯水完全溶解，稀释至刻度。分别准确移取0.5 mL待测大观霉素标准溶液和盐酸大观霉素样品溶液于5 mL离心管中，再分别加入2 mL三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液和2 mL 2，4-二硝基苯肼（DNPH）-乙腈溶液，将离心管置于旋涡振荡器上充分振荡，然后放置在70 ℃恒温水浴锅中进行衍生化反应60 min，结束后放置于冰水中，待其冷却后加入丙酮0.5 mL以终止反应，充分振荡，再置于70 ℃恒温水浴锅中加热10 min，取出后在室温下自然冷却，然后11 000 r/min离心10 min，过膜后利用HPLC进行检测。
　　2 结果与分析
　　2.1 抗生素微生物检定法（管碟法）检测
　　抗生素微生物检定法的检测数据结果见表1，其中所使用的标准品效价为644.0 IU/mg。使用ZY-300IV多功能微生物自动测量分析仪读数分析后，可知该盐酸大观霉素原料药的效价为668.5 IU/mg，其中平均可信限率FL=4.243 1%，偏离平行F3=3.842 6，P>0.05。同法平行试验测得结果为该盐酸大观霉素原料药的效价为672.7 IU/mg，其中平均可信限率FL=4.692 3%，偏离平行F3=1.840 8，P>0.05。
　　 根据《中华人民共和国兽药典》（2015年版第一部）要求，平均可信限率不得大于5%，偏离平行F3不得大于5，P应大于0.05。由表1可知，结果均符合规定，平均效价为670.6 IU/mg。
　　2.2 高效液相色谱检测
　　2.2.1 线性关系考察。
　　将配制的5个不同浓度的大观霉素标准品溶液进行高效液相色谱法检测，其检测结果见图1。由图1可知，盐酸大观霉素浓度在100～900 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为y=9.376 1x+122.15（R2=0.999 7）。
　　2.2.2 回收率試验。
　　由表2可知，所配制的80%、100%和120% 3个已知浓度样品的回收率分别是79.2%、99.0%、120.8%，经过计算可知其平均回收率为99.7%，表明该试验大观霉素检测方法的回收率良好。
　　2.2.3 精密度试验。由表3可知，100、500和900 μg/mL 3组不同浓度大观霉素标准品溶液的批内变异系数分别为1.12%、0.42%和0.10%，平均批内变异系数为0.55%，表明该试验的大观霉素检测方法精密度良好。
　　2.2.4 稳定性试验。由表4可知，在放置0、3和6 h检测的大观霉素标准品溶液以峰面积计算的RSD分别为0.33%、0.17%和0.21%，表明该试验方法所处理的大观霉素标准品溶液在6 h内检测含量稳定。
　　2.2.5 杂质干扰试验。
　　利用高效液相色谱检测的盐酸大观霉素空白、大观霉素标准品溶液与盐酸大观霉素供试品溶液的高效液相色谱图见图2～4。
　　通过对比标准品和供试品的出峰时间可知，供试品出峰时间和对照品出峰时间一致，由此定性说明此供试品是大观霉素;通过观察供试品和辅料空白图谱可知，在供试品出峰时间内，空白辅料未检测出峰面积，说明辅料对试验结果无影响。
　　2.2.6 含量测定。
　　盐酸大观霉素原料药经高效液相色谱法检测分析后得其含量结果见表5。由表5可知，测量的3个平行样品的检测效价结果分别为676.8、676.0和676.2 IU/mg，其平均效价值为676.3 IU/mg，后经自动水分滴定仪检测该原料药的水分为16.3%，其含量按干燥品计算结果为808.0 IU/mg，而2015版兽药典第一部规定盐酸大观霉素标准含量应大于779.0 IU/mg，由此可见该原料符合兽药典规定，判定该批原料合格。 　　3 讨论
　　3.1 管碟法的优缺点
　　抗生素微生物检定法（管碟法）是我国兽药典中盐酸大观霉素含量测定的标准方法。该方法主要是利用抗生素在琼脂培养基中的扩散作用，来比较标准品溶液与供试品溶液二者对接种的试验菌种的抑制作用，即表现在琼脂培养基上抑菌圈的大小，以此来测定供试品的效价。管碟法的优点是特异性强、灵敏度高，但是也有明显的不足：①整个操作过程繁琐复杂，工作量大，测定周期长，且需要精确熟练的操作。②对于操作空间要求较高，操作前需要对微生物室、操作台、试验使用的器材设备等进行灭菌，确保试验过程不被其他杂菌污染。③肺炎克雷伯氏菌是条件致病菌，试验安全性低，且菌种的保存要求高，需传代培养，制备的菌液容易在操作过程中被杂菌污染，需现配现用。④该方法测定的是总效价，无法区别主要成分和其他相关组分的含量，也不能确定杂质的有关信息，因此不能直观地反映盐酸大观霉素的纯度[2]。
　　3.2 高效液相色谱检测法条件的选择
　　由于大观霉素没有特征性紫外吸收光谱，所以该试验采用了衍生化法。利用大观霉素结构中的活泼基团与衍生试剂形成在紫外区有吸收的基团，以便于紫外检测[1]。
　　该试验选择了乙腈-四氢呋喃-水（35∶35∶30）为流动相，此流动相比例能缩短出峰时间，并且杂峰分离清晰，互不干扰，便于盐酸大观霉素含量的检测。
　　3.3 衍生试剂的选择
　　该试验选用了三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液和2，4-二硝基苯肼（DNPH）-乙腈溶液为衍生试剂，2，4-二硝基苯肼（DNPH）可与大观霉素的羰基反应生成苯腙化合物2，4-二硝基苯肼（DNPH）-大观霉素[14]，反应需在酸性条件下进行，三氟乙酸（TFA）即用于控制反应过程中的酸性条件[15]。文献报道，三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液的浓度有3%[16]和6%[14]，使用这2种浓度的三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液发现，经其处理后的大观霉素标准品溶液和盐酸大观霉素供试品溶液降解速度快，不利于检测。而提高三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液的濃度为9%[17]后，大观霉素标准品溶液和盐酸大观霉素供试品溶液不容易降解，并且稳定性至少可以维持6 h。
　　3.4 注意事项
　　抗生素微生物检定法（管碟法）中应注意菌种菌液的保存及试验器材的灭菌，而且要将高压灭菌的器材放入烘箱中烘干，不能残留水分;铺培养皿时要边铺边摇晃，使得琼脂培养基铺平、铺满且不能有气泡;向培养基中加菌液时，要求培养基的温度在50 ℃左右，以确保细菌的活性;使用移液器向牛津杯中注入大观霉素标准品溶液和盐酸大观霉素供试品溶液时要注意掌握力度，缓慢注入，且每个牛津杯注入的量要保持一致，不能溅到牛津杯外。
　　高效液相色谱检测法中，大观霉素标准品溶液和盐酸大观霉素样品溶液要同时配制同时衍生，配制完成标准品溶液和样品溶液应放在避光处保存。
　　4 结论
　　该研究分别采用HPLC法和抗生素微生物检定法（管碟法）对盐酸大观霉素含量进行测定，2种方法测得结果基本一致。HPLC法测得盐酸大观霉素浓度在100～900 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系，同时具有良好的回收率、精密度及稳定性，且该方法检测周期短、操作简便、准确性高，比管碟法更适用于企业对盐酸大观霉素原料及相关半成品和成品的质量监控。
　　参考文献
　　[1] 王忠.复方林可霉素-大观霉素注射液的研制[D].广州：华南农业大学，2011.
　　[2] 黄海婵，裘娟萍.大观霉素分析方法的研究进展[J].中国兽药杂志，2006，40（11）：16-19.
　　[3] TAO Y，CHEN D，YU G，et al.Simultaneous determination of lincomycin and spectinomycin residues in animal tissues by gas chromatographynitrogen phosphorus detection and gas chromatographymass spectrometry with accelerated solvent extraction[J].Food additives and contaminants：Part A，2011，28（2）：145-154.
　　[4] Council of Europe.European Pharmacopoeia：3rd[S].Strasbourg，France：European Department for the Quality of Medicines，1997：1152.
　　[5] 刘晓霞，丁利，张莹，等.高效液相色谱-串联质谱法测定乳及乳制品中大观霉素药物残留[J].分析实验室，2010，29（8）：48-51.
　　[6] KUCHTA S L，CESSNA A J.Lincomycin and spectinomycin concentrations in liquid swine manure and their persistence during simulated manure storage[J].Archives of environment contamination and toxicology，2009，57（1）：1-10.
　　[7] 任丹丹，习玲玲，黄伟民，等.高效阴离子交换色谱-铜/ 铂修饰电极安培法测定大观霉素[J].分析化学，2010，38（11）：1563-1567.
　　[8] 习玲玲.液相色谱-电化学法测定氨基糖苷类抗生素药物分析方法的研究[D].杭州：浙江大学，2008：79-103.
　　[9] WANG J，HU X J，TU Y，et al.Determination of spectinomycin hydrochloride and its related substances by HPLCELSD and HPLCMSn[J].J Chromatography B，2006，834（1/2）：178-182. 　　[10] WANG M J，HU C Q.Analysis of spectinomycin by HPLC with evaporative lightscattering detection[J].Chromatographia，2006，63：255-260.
　　[11] KRZEK J，KWIECIEN'  A，STAREK M，et al.Identification and determination of oxytetracycline，tiamulin，lincomycin and spectinomycin in veterinary preparations by thinlayer chromatography/densitometry[J].Journal of association of official analytical chemists international，2000，83（6）：1502-1506.
　　[12] HAAGSNA N，SCHERPENISSE P，SIMMONDS R J，et al.Highperformance liquid chromatographic determination of spectinomycin in swine，calf and chicken plasma using postcolumn derivatization[J].J Chromatography B，1995，672（1）：165-171.
　　[13] 中國兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[S].北京：中国农业出版社，2015.
　　[14] 金燕华.大观霉素分析检测方法的比较与壮观链霉菌原生质体的制备[D].杭州：浙江工业大学，2008.
　　[15] ABUBASHA E A，GEHRING R，ALBWA’NEH S J.Pharmacokinetics and bioavailability of spectinomycin after i.v.，i.m.，s.c.and oral administration in broiler chickens[J].Journal of veterinary pharmacology & therapeutics，2007，30（2）：139-144.
　　[16] BURTON S D，HUTCHINS J E，FREDERICKSEN T L，et al.High-performance liquid chromatographic method for the determination of spectinomycin in turkey plasma[J].Journal of chromatography B，1991，571（1/2）：209-216.
　　[17] YAN H D，XU P Y，HUANG H C，et al.Analysis of spectinomycin in fermentation broth by reversedphase chromatography[J].Chemical papers，2009，63（6）：635-640.
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