超高效液相色谱-串联质谱法快速测定红枣中甜菜碱

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　　摘要 [目的]建立红枣中甜菜碱的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）快速分析测定方法。[方法]样品经甲醇超声提取，正相硅胶色谱柱（HILIC，50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，乙腈-水等度洗脱，采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）正离子模式对红枣中甜菜碱进行测定。[结果]在优化条件下，甜菜碱在1～200 ng/mL均呈现良好的线性关系（R2=0.998 8），检出限为0.025 mg/kg，定量限为0.050 mg/kg。在红枣样品中进行3个水平的添加试验（n=6），平均回收率为83.6%～94.2%，相对标准偏差1.6%～2.7%。对红枣样品中甜菜碱进行了测定，含量在0.39～3.04 g/kg。[结论]该方法适用于红枣样品中甜菜碱的测定。
　　关键词 甜菜碱;超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）;红枣
　　中图分类号 TS 207.3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）17-0213-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.055
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Rapid Determination of Betaine in Red Date by UPLC MS/MS
　　ZHANG Jin lei， XING Li jie， WANG Yuan et al
　　（ Analysis and Testing Center， Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation Science， Shihezi， Xinjiang 832000）
　　Abstract [Objective] To establish an ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC MS/MS） rapid analysis method for betaine in red dates.[Mothod]Samples were extracted by ultrasound with acetonitrile，and then the analyses were separated on an silica gel column （50 mm×2.1 mm， 1.7 μm） by gradient elution using a mixture of water and acetonitrile as mobile phase. The determination of betaine in red date was performed by electrospray ionization in the positive ion mode under multiple reaction monitoring （MRM） mode. [Result]Under optimized conditions， betaine showed a good linear relationship between 1 and 200 ng/mL （R2 = 0.998 8）. The detection limits and quantification limits were 0.025 mg/kg and 0.050 mg/kg.The average recovery rate was 83.6%-94.2% at the three spiked levels in blank red date samples （n=6）， and the relative standard deviation was 1.6%-2.7%. The method was applied to the determination of red date samples， and the content was 0.39-3.04 g/kg. [Conclusion]The method is suitable for determination of betaine in red date.
　　Key words Betaine;Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC MS/MS）;Red date
　　紅枣是我国700多个品种中干食最为优良的品种之一，主要种植在山东、山西、陕西、河南、河北、甘肃和新疆等地。由于地理位置和自然环境的不同，红枣中的化学成分差异很大[1]。红枣具有丰富的营养成分，包括糖类、脂肪酸、氨基酸、矿物质、维生素、多酚等抗氧化物质[2]。据报道，红枣中的活性物质具有抗炎、抗氧化、护肝、抑制乳腺癌细胞和调节免疫活性的能力[3-6]。
　　甜菜碱是一种水溶性的季铵盐化合物[7-8]，是红枣中主要的生物碱之一，具有调节体内渗透压、促进脂肪代谢、提供甲基供体的功能。同时，在防止肝损伤和抑制癌症的发展中具有重要的生物学意义[9-10]。目前测定甜菜碱含量的方法主要包括比色法[11]、滴定法[12]、薄层色谱法[13]、离子色谱法[14-15]、高效液相色谱法[16-17]、液相色谱-串联质谱法[18-20]等。其中，比色法前处理较为繁琐，结果的准确度和重复性较低;滴定法虽然成本低，但受样品中色素等杂质的干扰，测定终点不易判断;高效液相色谱法测定甜菜碱，由于甜菜碱结构中无共轭体系，几乎没有紫外吸收，需要在低波长下才能检测，灵敏度相对较低。液相色谱-串联质谱法是近年来比较主流的分析工具，以其分析速度快、准确性和灵敏度高等特点被广泛应用于农产品和食品检测。 　　该研究建立了快速测定红枣中甜菜碱的超高效液相色谱-串联质谱方法，优化了提取溶剂、超声时间和提取体积等因素对提取效率的影响，并将该方法应用于实际红枣样品的测定。
　　1 材料与方法
　　1.1 试剂与材料
　　甲醇、乙腈、乙酸铵、甲酸（HPLC级），德国CNW公司;甜菜碱（纯度>98.9%），德国Dr.Ehrenstorfer公司;超纯水;红枣（购置于新疆地区不同超市、农贸市场和生产基地）去核，经匀浆机（10 000 r/min）匀浆后装入样品袋中置于-20 ℃下冷冻保存备用。
　　1.2 仪器设备
　　超高效液相色谱-串联质谱仪（Waters Xevo TQ），美国Waters公司;漩涡混合器（MS3 basic），德国IKA公司;高速冷冻离心机（Sigma 3-30k），德国Sigma公司;超声波清洗器（KQ-600DE型），昆山市超声仪器有限公司;超纯水仪（ULPHW-IV），四川优普超纯科技有限公司。
　　1.3 UPLC-MS/MS检测条件
　　色谱柱：BEH HILIC柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱温30 ℃;流动相组成：水-乙腈（体积比25∶75）;进样量5 μL;流速0.4 mL/min，等度洗脱。
　　离子化模式：电喷雾离子源（ESI），正离子模式;质谱扫描方式：多反应监测（MRM）;毛细管电压3.2 kV，离子源温度150 ℃，脱溶剂温度400 ℃，脱溶剂气流量800 L/h。甜菜碱在MRM模式下的母离子为118，子离子为58*/59（*为定量离子），锥孔电压34 V，碰撞能量21*/17 eV。
　　1.4 样品前处理
　　称取经匀浆后的红枣1.00 g（精确至001 g）于50 mL离心管中，加入25 mL甲醇，涡旋振荡1 min，30 ℃下恒温超声提取30 min;在10 000 r/min下离心5 min，转移至另一支50 mL离心管中;在残渣中继续加入10 mL甲醇，30 ℃下恒温超声提取30 min;在10 000 r/min下离心5 min，合并上清液，取上清液过0.22 μm有机滤膜，经UPLC-MS/MS分析。待测物含量过高的样液，用甲醇适当稀释至线性范围内再进行测定。
　　1.5 标准溶液的配制
　　准确称取甜菜碱标准品10 mg，用甲醇溶于10 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，置于-20 ℃避光保存。用甲醇将标准储备液逐级稀释，配制成1、2、5、10、20、50、100和200 ng/mL的甜菜碱系列工作溶液，置于4 ℃避光保存。
　　2 结果与分析
　　2.1 质谱和色谱条件的优化
　　2.1.1 质谱条件的优化。
　　在电喷雾电离和多反应监测模式下，对500 ng/mL甜菜碱标准溶液流动注射泵连续进样，通过对脱溶剂温度、毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数进行优化。选择稳定性好、丰度高和干扰小的2个碎片离子作为甜菜碱定性离子和定量离子，并以丰度最强、响应值最高的离子对作为定量离子对。图1为浓度为500 ng/mL标准溶液中甜菜碱的MRM离子对质谱图。
　　2.1.2 色谱条件的优化。
　　通过比较水-乙腈、水-甲醇、水（含0.1%甲酸）-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇和5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）-乙腈5种流动相体系对甜菜碱响应的影响，结果发现（图2），当流动相为水-乙腈体系和5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）-乙腈时，甜菜碱的响应较高;而当流动相为5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）-乙腈时，甜菜碱色谱峰具有更好的对称性。因此该试验最终选择5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）-乙腈作为检测红枣中甜菜碱的流动相体系。
　　2.2 前处理条件的优化
　　2.2.1 提取溶剂的优化。
　　该试验分别采用纯水、20%甲醇水溶液、40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液和纯甲醇6种不同溶剂提取红枣中的甜菜碱。从图3可看出，随着甲醇含量的增加，甜菜碱的提取效率也不断增加，提取回收率在75%～95%。當采用纯甲醇提取，回收率达到最大值（95%），高于其他提取溶剂，因此该试验选取纯甲醇作为最佳提取溶剂。
　　2.2.2 提取溶剂体积的优化。
　　采用甲醇提取红枣中的甜菜碱，在样品量和其他条件一致的情况下，考察了不同体积（10、15、20、25、30 mL，分2次提取）甲醇对甜菜碱提取效率的影响。结果发现（图4），随着甲醇体积的增大，回收率先升高后下降。当甲醇提取溶液体积为25 mL时，提取效率最高。
　　2.2.3 超声时间对提取效率的影响。
　　在优化的提取溶剂和体积条件下，该研究考察了不同超声时间（10、20、30、40、50、60 min）对甜菜碱提取效率的影响。结果表明（图5），随着超声时间的增加，提取效率先增大后减小。当超声提取时间为30 min时，甜菜碱的提取效率最高。故该试验选择超声30 min为最优提取时间。
　　2.3 方法学考察
　　2.3.1 线性关系和检出限。
　　通过向红枣基质中添加与本身
　　含量相当量的甜菜碱标准品，比较添加前后的峰面积，评价其基质效应大小。根据试验结果显示，红枣中甜菜碱检测的基质效应不显著。在优化的前处理和仪器条件下，对一系列甜菜碱标准工作溶液进行了测定，以定量离子峰面积为纵坐标、浓度为横坐标进行回归分析，得出线性方程为y=1 053.81x+104397（R2=0.998 8），表明甜菜碱在1～200 ng/mL呈现良好的线性关系。在信噪比S/N为3时，计算甜菜碱的检出限为0.025 mg/kg，在信噪比S/N为10时，计算甜菜碱的定量限为0.05 mg/kg。该方法线性关系良好、灵敏度高。 　　2.3.2 回收率和精密度。
　　任意选取一份红枣样品，按照该试验方法进行3个浓度水平添加测定回收率，每个水平重复测定6次。从表1可以看出，红枣中甜菜碱的平均回收率为83.6%～94.2%，相对标准偏差为1.6%～2.7%，说明该方法回收率和精密度良好。
　　2.4 实际样品的测定
　　收集了新疆地区不同品种的红枣样品共96个。按照优化的试验条件，对红枣样品进行了测定。结果显示，所有收集样品中均检出甜菜碱，含量在0.39～304 g/kg，说明不同品种红枣中甜菜碱的含量有所差异。
　　3 结论
　　采用HILIC色谱柱分离，优化了仪器和前处理条件，通过优化提取溶剂、提取溶剂体积和超声时间等因素，提高了红枣中甜菜碱的提取效率。在方法学验证和实际样品测定结果中表明，该方法具有灵敏度高、准确性好、分析速度快的特点，适用于红枣中甜菜碱的定性定量检测。
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