QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法同时测定大米、小麦和动物源食品中异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆残留

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　　摘要 本研究建立了超高效液相色譜串联质谱法（UHPLC-MS/MS）同时测定异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆在大米、小麦、牛肉、牛奶、鸡肉和鸡蛋的残留检测方法。样品经2%甲酸乙腈提取，以N-丙基乙二胺（PSA）净化，利用乙腈和0.2%甲酸水作为流动相梯度洗脱，T3色谱柱分离，在多反应监测模式下定量分析，基质外标法定量。结果表明：异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆溶剂标准曲线和基质标准曲线在1～1 000 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99。在4个加标水平下，异丙隆日内平均回收率为74.0%～107.0%，相对标准偏差0.7%～12.9%;日间平均回收率为76.2%～108.7%，相对标准偏差1.1%～19.8%。脱甲基异丙隆日内平均回收率为76.9%～113.5%，相对标准偏差0.6%～13.9%;日间平均回收率为77.7%～107.4%，相对标准偏差2.2%～17.4%。异丙隆和脱甲基异丙隆的定量限均为1.0 μg/kg。该方法简便、快捷、准确、灵敏度高，适用于异丙隆和脱甲基异丙隆在大米、小麦、牛肉、牛奶、鸡肉和鸡蛋6种基质中残留的检测，为解决异丙隆和脱甲基异丙隆在食品中残留的安全问题提供技术方法。
　　关键词 QuEChERS; 超高效液相色谱串联质谱法; 异丙隆和脱甲基异丙隆; 食品
　　中图分类号： S 481.8
　　 文献标识码： A
　　 DOI： 10.16688/j.zwbh.2019479
　　Simultaneous determination of isoproturon and its metabolite
　　desmethyl-isoproturon in rice， wheat and animal foods by
　　QuEChERS-UHPLC-MS/MS
　　DAI Gaochen1，2， WU Xiaohu2， ZHANG Ying2， CUI Kai2， DONG Fengshou2，
　　LIU Xingang2， XU Jun2， ZHENG Yongquan2， QIN Fanxin1
　　（1. Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment
　　of Guizhou Province， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China; 2. State Key Laboratory for
　　Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of
　　Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）
　　Abstract
　　A method for the simultaneous determination of isoproturon and its metabolite （desmethyl-isoproturon） in rice， wheat， beef， milk， chicken and egg samples by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UHPLC-MS/MS） was established. The experimental samples were extracted with 10 mL acetonitrile containing 2% formic acid and purified by matrix dispersion extraction with 50 mg PSA as adsorbent. The mobile phase was eluted with acetonitrile and 0.2% formic acid aqueous solution. The analytes were separated on an ACQUITY UPLC HSS T3 column （2.1 mm×100 mm， 1.8 μm） and quantitatively analyzed by the external standard method using matrix-matched calibration curves. The results showed that the linear relationships between isoproturon and its metabolite desmethyl-isoproturon were good in the range of 1 to 1 000 μg/L， with the correlation coefficients all higher than 0.99. At four spiked levels， the intra-day average recoveries of isoproturon were 74.0%-107.0% （RSD 0.7%-12.9%）， the inter-day average recoveries were 76.2%-108.7% （RSD 1.1%-19.8%）， respectively. The intra-day average recoveries of desmethyl-isoproturon were 76.9%-113.5% （RSD 0.6%-13.9%）， the inter-day average recoveries were 77.7%-107.4% （RSD 2.2%-17.4%）， respectively. The limits of quantification （LOQs） were 1.0 μg/kg for isoproturon and desmethyl-isoproturon. The developed method is convenient， rapid， accurate and reliable， which could be applied for the simultaneous detection of isoproturon and desmethyl-isoproturon in rice， wheat， beef， milk， chicken and egg. It was of great significance to solve the safety problems for the residue of isoproturon and desmethyl-isoproturon in foods. 　　Key words
　　QuEChERS; UHPLC-MS/MS; isoproturon and desmethyl-isoproturon; foods
　　异丙隆（isoproturon），3-（4-异丙基苯基）1，1-二甲基脲，是一种取代脲类选择性除草剂[12]，是我国应用最广、施用量最大的麦田除草剂之一，可用于小麦、棉花、花生、玉米、水稻、豆类作物，能够有效控制一年生禾本科杂草和阔叶杂草[34]。该药通过根部或者叶部进入靶标植物中，阻断光合作用系统Ⅱ中的电子传递，从而杀死杂草[5]。
　　异丙隆在土壤中的残效期较长，甚至可达一年以上[4]。欧洲食品安全局（EFSA）的报告显示，异丙隆的残留检测主要集中于小麦和大米等谷物类产品。异丙隆为二类致癌物质，对大鼠、狗和猴子等哺乳类动物的肝脏有毒性，并且会对哺乳动物的内分泌系统造成影响。异丙隆会在土壤和地下水环境中通过去甲基化反应生成代谢物脱甲基异丙隆（desmethyl-isoproturon），脱甲基异丙隆具有较高的土壤迁移率和较高的致癌风险，同时对大鼠有中等急性毒性，会导致物种染色体畸变以及可能会导致基因突变[6]。在我国食品国家安全标准中，异丙隆在糙米和小麦中的残留最大限量为0.05 mg/kg。随着防草除害的需要，异丙隆的使用量不断增加。异丙隆存在于土壤、水环境以及小麦、水稻等相关作物中，并且由于去甲基化反应的发生，会生成其代谢物脱甲基异丙隆，在小麦、水稻等相关谷物类作物中残留[56]。这两种化合物通过食物链在牛肉、鸡肉等动物产品中也会有残留，进而可能对人类健康产生潜在的风险。因此，建立一种适用于同时快速检测小麦、水稻作物以及牛肉、鸡肉等动物制品中异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆的测定方法对保障作物安全生产及人类健康具有重要意义。
　　目前，异丙隆的检测方法主要有气相色谱质谱法（GC/MS）[78]和高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）[912]等，前处理方法主要有固相萃取法（SPE）[7]、基质固相分散法[9]和索氏提取固相萃取法[11]等，主要检测基质为小麦、土壤和水体;异丙隆代谢物脱甲基异丙隆的检测方法主要为高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）[1317]，前处理方法主要有QuEChERS[14]法，固相萃取法（SPE）[15]等，主要检测基质为大米、土壤和水体。其中，UHPLC-MS/MS技术结合QuEChERS前处理方法操作简单，分析时间少，具有高灵敏度和高准确性等优点，已成为异丙隆残留分析的重要手段。
　　当前大多数研究主要关注于异丙隆母体，对代谢物关注较少，且检测基质单一，对异丙隆的检测集中于土壤、水体、小麦和糙米基质，基质成分简单，对动物源等复杂基质的检测较少。而同时检测多种基质中异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆的方法尚未见报道。本研究建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS同时测定大米、小麦和4种动物源食品中异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆的检测方法。该方法简便、快捷、灵敏度高，为不同食品基质中异丙隆及脱甲基异丙隆残留监控和质量安全评价提供技术支撑。
　　1 材料与方法
　　1.1 试剂与仪器
　　异丙隆（98.9%）标准品购于北京勤诚亦信科技开发有限公司;脱甲基异丙隆（98.0%）标准品购于上海倍卓生物科技有限公司;色谱纯乙腈，德国默克公司;分析纯乙腈，中国国药集团化学试剂有限公司;超纯水，Milli-Q 美国MILLIPORE公司;甲酸（色谱纯），中国上海阿拉丁生化科技有限公司;N-丙基乙二胺（PSA），美国Agela Technologies公司。超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS，Acquity-TQD），美国Waters公司;Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm， 1.8 μm），美国Waters公司;CK2000高通量组织研磨仪，美国Thmorgan公司;TG16-WS台式快速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司;FW 100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;Filter unit滤膜（0.22 μm），Agela Technologies公司。
　　1.2 样品前处理
　　小麦和大米空白样品研磨成粉状，鸡肉和牛肉空白样品打碎成泥状。准确称取小麦、大米、鸡肉、牛肉、鸡蛋和牛奶样品各10.0 g（±0.1 g）于50 mL离心管中（其中小麦、大米、鸡肉、牛肉样品补5 mL超纯水），随后加入10 mL 2%甲酸乙腈，振荡3 min。加入1.5 g NaCl和4 g无水MgSO4，振蕩3 min后在5 000 r/min下离心5 min。取上清液1.5 mL置于装有50 mg PSA和150 mg无水MgSO4的2 mL离心管中，涡旋1 min，4 000 r/min下离心5 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜，待测。
　　1.3 标准溶剂的配制及标准曲线的绘制
　　称取异丙隆标准品（0.010 11±0.000 01）g，脱甲基异丙隆标准品（0.010 20±0.000 01）g，以色谱纯乙腈为溶剂分别配制成100 mg/L的储备液100 mL，于4℃冰箱中保存。分别准确移取适量的异丙隆和脱甲基异丙隆标准储备液，用色谱纯乙腈逐阶稀释成浓度为1 000、500、100、50、10、5、1 μg/L的系列混合标准溶液，按照预定的仪器条件测定，以质量浓度X（mg/L）为横坐标，相应的色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。
　　1.4 仪器条件
　　1.4.1 色谱条件
　　色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;柱温：45℃;流速0.3 mL/min;进样体积：5 μL;以乙腈和含体积分数0.2%（V/V）甲酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱，洗脱条件见表1。 　　1.4.2 质谱条件
　　采用超高效液相色谱串联质谱，三重四级杆检测器测定。离子源为电喷雾离子源，多反应监测（MRM）正离子模式（ESI+）;所用气体均为高纯氮气;毛细管电压3.0 kV;离子源温度120℃;去溶剂温度350℃;去溶剂气流量500 L/h;锥孔反吹气流量50 L/h。使用仪器对异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆的ESI和MS进行分析优化，结果如表2所示。
　　1.5 基质效应的计算
　　基质效应的强弱与基质种类有关，同时还受农药结构、浓度等理化性质的影响，如一些含有氨基、羟基和氨基甲酸酯基等官能团的农药极易吸附在检测器进样口的活性位点上，导致样品基质效应变化[1718]。除此之外，检测器和进样方式等也会对基质效应产生影响。
　　基质效应（Me）=（基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率-1）×100%。
　　Me=0，表示不存在基质效应;Me在-20%～20%时为弱基质效应;当 Me在-50%～-20%或20%～50% 时为中等基质效应;当Me≤-50%或>50%时为强基质效应[19]。
　　2 结果与分析
　　2.1 流动相的选择
　　在文献[1619]基础上，分别考察了甲醇水体系和乙腈0.2%甲酸水体系作为流动相时的洗脱效果。结果表明，使用甲醇水体系作为流动相时峰型不对称且峰型宽大，而乙腈0.2%甲酸水体系作为流动相时则显示出较好的峰型，且无杂质峰干扰，故选其作为流动相，并调整流动相的比例和流速以控制异丙隆及脱甲基异丙隆的保留时间。异丙隆和脱甲基异丙隆在该流动相洗脱梯度下峰型良好，色谱图如图1所示。
　　2.2 前处理方法的选择
　　2.2.1 前处理方法的优化
　　在QuEChERS方法中，基础的提取溶剂为乙腈[20]，乙腈有着优良的溶剂性能，能溶解多种有机、无机和气体物质。随着QuEChERS方法的不断改进和完善，在各种研究中实验人员会尝试在乙腈中加入不同比例的试剂，如甲酸等，以取得更好的回收率和更低的基质效应[21]。C18可以从极性样品中提取非极性和中极性化合物，主要用于反相萃取;PSA主要去除非极性样品中有机酸、色素、糖类和脂肪，主要用于正相萃取;florisil可以从非极性溶液中萃取极性化合物，主要吸附极性杂质和脂肪酸，以及从非水溶液中吸附低极性以及中等极性化合物;MWCNTs具有较大的比表面积、稳定的化学性质和较强的吸附能力等优点，且对色素有着明显的净化效果，近年来被作为一种新型吸附材料广泛应用于农药残留提取[2224]。大米和小麦主要成分为淀粉和蛋白质，牛肉、牛奶、鸡肉和鸡蛋，基质复杂，富含脂肪、蛋白质和一些其他親脂性化合物，这些化合物很容易与目标分析物共同提取。因此，合适的提取溶剂和净化剂对目标组分的准确提取非常重要。
　　本研究中考察了乙腈、1%甲酸乙腈和2%甲酸乙腈作为提取剂，PSA、florisil、C18和MWCNTs作为净化剂时异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆在6种食品基质中的回收率。结果如图2所示，在大米、小麦、牛肉、牛奶、鸡肉、鸡蛋6种基质的空白样品中，在10 μg/kg添加水平下，异丙隆和脱甲基异丙隆只有在鸡肉-2%甲酸乙腈-florisil组合下添加平均回收率分别为156%和143%，超过NY788-2016标准中所允许的回收率范围（70%～120%）[25]。而在剩余基质和提取条件下，异丙隆在不同基质中的平均回收率为72%～118%，相对标准偏差（RSD）为0.56%～15.97%;脱甲基异丙隆在不同基质中的平均回收率为72%～115%，相对标准偏差（RSD）为0.55%～12.82%。
　　2.2.2 基质效应
　　基于2.2.1中3种提取剂和4种净化剂的自由组合下，异丙隆和脱甲基异丙隆均具有较好的回收率，因此，本试验为了减少杂质对仪器的损害，进行了基质效应的测定和计算。异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆在不同基质、提取溶剂和净化剂中的基质效应的结果如图3所示，在6种基质中异丙隆的基质效应范围在-7.9%～203.3%之间，其中鸡肉、牛肉、牛奶和小麦4种基质中提取溶剂和净化剂为2%甲酸乙腈和PSA时基质效应最小，提取溶剂和净化剂分别为乙腈和MWCTNs时大米的基质效应最小，提取溶剂和净化剂分别为2%甲酸乙腈和florisil时鸡蛋的基质效应最小;脱甲基异丙隆的基质效应范围在-1.9%～162.8%之间，其中鸡肉、牛肉、牛奶和小麦4种基质中提取溶剂和净化剂为2%甲酸乙腈和PSA时基质效应最小，提取溶剂和净化剂分别为2%甲酸乙腈和C18时大米的基质效应最小，提取溶剂和净化剂分别为1%甲酸乙腈和florisil时鸡蛋的基质效应最小。为了在检测过程中降低基质效应对仪器的影响，在保证回收率的情况下，选择基质效应影响小的提取溶剂和净化剂作为提取方法。因此，经过对回收率和基质效应的综合对比，选择了2%甲酸乙腈作为提取剂和PSA作为净化剂。
　　2.3 线性关系和定量限
　　分别用小麦、大米、牛肉、牛奶、鸡肉、鸡蛋基质空白溶液配制1、5、10、50、100、500 μg/L和1 000 μg/L的异丙隆和脱甲基异丙隆标准溶液，按2.2前处理方法中所确定的色谱质谱条件进行测定。在1～1 000 μg/L范围内，异丙隆和脱甲基异丙隆的峰面积与质量浓度具有良好的线性关系（R2≥0.991 7），满足外标法定量检测的要求，其中线性回归方程及相关系数等参数见表3。以最小添加回收浓度确定两种目标化合物的定量限，定量限均为1 μg/kg。
　　2.4 方法的准确度和精密度
　　本方法的准确度及精密度用添加回收率和相对标准偏差来衡量。如表4所示，对异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆在6种空白基质进行4个水平添加回收试验（1、10、50 μg/kg和500 μg/kg），在3个不同的时间制备样品，每个水平重复5次。根据所述方法提取和净化异丙隆及脱甲基异丙隆，异丙隆日内平均回收率在74.0%～107.0%之间，相对标准偏差0.7%～12.9%;日间平均回收率在76.2%～108.7%，相对标准偏差在1.1%～19.8%之间。异丙隆代谢物脱甲基异丙隆日内平均回收率在76.9%～113.5%之间，相对标准偏差0.6%～13.9%;日间平均回收率在77.7%～107.4%之间，相对标准偏差在2.2%～17.4%之间。结果表明，本方法的准确性、再现性均符合我国农药残留分析的要求[25]。 　　2.5 实际样品测定
　　采用本研究建立的异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆残留分析方法，对从农产品市场上购买的大米、小麦、牛肉、牛奶、鸡肉和鸡蛋6种基质各10份，共60份样品进行检测。结果如表5所示，实际样品异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆残留量在牛肉、牛奶、鸡肉和鸡蛋4种基质未检出。异丙隆在大米中检出2次，检出含量1.6～7.5 μg/kg。脱甲基异丙隆在大米中检出2次，检出含量3.6～5.8 μg/kg;在小麦种检出2次，检出含量1.4～3.9 μg/kg。
　　3 结论
　　本研究建立了同时测定大米、小麦、牛肉、牛奶、鸡肉、鸡蛋6种基质中异丙隆及其代谢物脱甲基异丙隆的一种简便可靠的残留分析方法。该方法能够同时制备6种不同的基质样品，并通过超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）方法进行分析。样品前处理操作简单，方法的线性范围、检测限、定量限、平均添加回收率及其相对标准偏差等性能指标均满足农药残留分析要求，适用于常用除草剂中异丙隆及脱甲基异丙隆多残留的快速、准确定性和定量分析。
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　　（责任编辑：杨明丽）
　　收稿日期： 20190910   修订日期： 20191117
　　基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201503017）
　　致  谢： 参加本试验部分工作的还有江代礼、谭翰杰、张能和纪烨斌等同学，特此一并致谢。
　　通信作者E-mail：吴小虎xhwu@ippcaas.cn;秦樊鑫qinfanxin@gznu.edu.cn
　　#为并列第一作者
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