甘草超高液相色谱指纹图谱研究
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作者:孙云波 张创峰 毕丹 田清存 崔旭盛 沈硕
摘要：目的 建立甘草的超高液相色谱（UPLC）指纹图谱，为其质量标准的建立提供依据。方法 采用反相超高液相色谱法，以Waters Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）为色谱柱，乙腈-0.05%磷酸为流动相，梯度洗脱，流速0.4 mL/min，检测波长分别为237、355 nm，柱温30 ℃，进样量2 μL，记录时间51 min。结果 UPLC指纹图谱的方法学考察结果符合技术要求。共标定甘草UPLC指纹图谱的24个指纹峰，指认其中甘草酸、芹糖基异甘草苷、甘草查尔酮A、异甘草素、甘草苷、甘草素、异甘草苷、刺甘草查尔酮和光甘草定9个指纹峰。11批甘草样品指纹图谱在波长237 nm处的相似度为0.940～0.988，波长355 nm处的相似度为0.831～0.982。结论 本研究建立的甘草UPLC指纹图谱可为甘草质量标准的建立提供依据。
关键词：甘草;超高液相色谱;指纹图谱;甘草酸;相似度分析;质量标准
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2020）01-0068-05
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201812371
Study on UPLC Fingerprints of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
SUN Yunbo1，2， ZHANG Chuangfeng1， BI Dan1， TIAN Qingcun3， CUI Xusheng3， SHEN Shuo1，2
1. Beijing Yiling Pharmaceutical Co.， Ltd， Beijing 102600， China;
2. Hebei Province Institute of Integrated Traditional and Western Medicine， Shijiazhuang 050035， China;
3. Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co.， Ltd， Shijiazhuang 050035， China
Abstract： Objective To establish UPLC fingerprints of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， and to provide a basis to develop the quality standard. Methods RP-UPLC fingerprints were adopted， and Waters Acquity UPLC BEH C18 （1.7 ?m， 2.1 mm × 100 mm） was set as the chromatographic column. Acetonitrile-0.05% phosphoric acid was used as the mobile phase， for gradient elution; the flow rate was 0.4 mL/min; the detection wavelengths were set at 237 nm and 355 nm; the column temperature was kept at 30 ℃; the sample volume was 2 μL; the recording time was 51 min. Results The methodological findings of UPLC fingerprints met the technical standard. 24 fingerprint peaks were marked in Glycyrrhizae Radix et Rhizoma. 9 fingerprint peaks including glycyrrhizic acid， isoliquiritin apioside， licochalcone A， isoliquiritigenin， liquiritin， liquiritigenin， isoliquiritin， echinatin and glabridin were identified. The similarities of 11 batches of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma were among 0.940–0.988 at 237 nm and among 0.831–0.982 at 355 nm. Conclusion The established UPLC fingerprints of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma can provide basis for the establishment of its quality standard.
Keywords： Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; UPLC; fingerprints; glycyrrhizic acid; similarity analysis; quality standards
甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎，春、秋二季采挖，除去须根，晒干。甘草气微，味甜而特殊，具有和中缓急、润肺祛痰、止咳平喘、补脾益气、清热解毒、调和诸药之功[1]，为临床常用补益药[2]。2015年版《中华人民共和国药典》（一部）规定以甘草苷不得少于0.50%、甘草酸不得少于2.0%作为甘草质量控制标准[1]，但甘草化学成分复杂，含有甘草酸类、黄酮类、多糖类、三萜皂苷类、木质素类及氨基酸类等多种化学成分[3-5]，药理作用丰富[6-8]，其药效为多种成分共同发挥作用的结果，仅对1种黄酮类和1种皂苷类成分进行定量分析不能从整体上反映甘草的内在质量。 中药指纹图谱技术作为一种从整体上控制质量的手段，能很好地反映色谱峰信息量较大的中药质量，特征图谱则能更好地反映色谱峰信息量相对较少的中药质量。中药指纹图谱具有分析速度快、分离效能高等优点，是目前广泛应用的快速检验药材质量的技术[9-12]。甘草主产地资源丰富，采收较容易，资源易得到保证。由于甘草色谱峰信息量较大且复杂，故本研究采用具有高分离效能的超高液相色谱法（UPLC）建立甘草指纹图谱，从而对甘草药材进行更为有效的质量控制，促进道地产区甘草药材生产稳定发展。
1 仪器与试药
Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统，配有四元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、柱温箱、PDA检测器和Empower 3色谱工作站，美国Waters公司;Milli-Q超纯水处理系统，美国Millipore Bedford;KQ-500DB型超声波清洗器（功率500 W，频率40 kHz），昆山市超声仪器有限公司;AL204型、AB135-S型电子分析天平，瑞士Mettler- Toledo International Inc.;JA2603B电子天平，上海精科仪器有限公司;0.2 ?m微孔滤膜（美国Waters）。
甘草酸（上海源叶生物科技有限公司，批号Z30A6B1，纯度>98%），芹糖基异甘草苷（上海源叶生物科技有限公司，批号P18M3R1，纯度>98%），甘草查尔酮A（成都普瑞法科技开发有限公司，批号14022606，纯度>98%），异甘草素（上海源叶生物科技有限公司，批号R12A7F19390，纯度>98%），甘草苷（中国食品药品检定研究院，批号111610-201106，含量以93.7%计），甘草素（上海源叶生物科技有限公司，批号ZM0314BD14，纯度>98%），异甘草苷（成都普瑞法科技开发有限公司，批号14012002，纯度>98%），刺甘草查尔酮（上海源叶生物科技有限公司，批号RA0817FA14，纯度>98%），光甘草定（成都普瑞法科技开发有限公司，批号14030509，纯度>98%），乙腈（色谱纯，美国Fisher），甲酸、冰醋酸、磷酸为分析纯，北京化工厂），水为超纯水（Milli-Q制备）。11批甘草药材来自甘肃省不同地区，经石家庄以岭药业股份有限公司中药资源部田清存高级工程师鉴定为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎，样本存放于北京以岭药业有限公司，样品来源见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脱（见表2），柱温30 ℃，检测波长分别为237、355 nm，进样量2 μL。
2.2 供试品溶液制备
取样品粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入70%乙醇10 mL，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀静止，取上清液，0.2 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3 对照品溶液制备
取甘草酸、芹糖基异甘草苷对照品适量，精密称定，置具塞容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含甘草酸1.460 mg、芹糖基异甘草苷1.066 mg的溶液，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验
取同一份甘草（S9）供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件测定，将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723版）。在237 nm波长处，以甘草酸峰为参照峰（S），计算其他9个色谱峰的相对保留时间RSD均小于1.88%，相对峰面积RSD均小于2.97%;在355 nm波长处，以芹糖基异甘草苷峰为参照峰（S），计算其他13个色谱峰的相对保留时间RSD均小于1.33%，相对峰面积RSD均小于4.34%。所得色谱图的24个指纹峰，在波长237 nm处的相似度分别为1.000、0.998、0.999、1.000、0.999、1.000，RSD=0.09%;在波长355 nm处的相似度分别为0.999、0.991、0.999、0.999、0.997、0.989，RSD=0.33%。表明仪器的精密度良好。
2.4.2 稳定性试验
取同一份甘草（S9）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723版）。在237 nm波长处，以甘草酸峰为参照峰（S），计算其他9个色谱峰的相对保留时间RSD均小于2.49%，相对峰面积RSD均小于2.77%;在355 nm波长处，以芹糖基异甘草苷峰为参照峰（S），计算其他色谱峰的相对保留时间RSD均小于1.42%，相对峰面积RSD均小于5.12%。所得色谱图的24个指纹峰，在波长237 nm处的相似度分别为0.998、0.998、0.999、0.999，0.999、0.999、0.998、0.999，RSD=0.06%;在波长355 nm处的相似度分别为0.996、0.995、0.999、0.998、0.999、0.999，0.997、0.997，RSD=0.16%。表明供試品溶液在24 h内稳定。
2.4.3 重复性试验
取同一批甘草（S9），按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。237 nm波长处以色谱峰19甘草酸为参照峰（S），计算其他9个色谱峰的相对保留时间RSD均小于1.00%，相对峰面积RSD均小于3.16%;355 nm波长处以色谱峰8芹糖基异甘草苷为参照峰（S），计算其他13个色谱峰的相对保留时间RSD均小于1.00%，相对峰面积RSD均小于3.36%。所得色谱图的24个指纹峰在波长237 nm的相似度分别为1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000，RSD=0.00%;在波长355 nm的相似度分别为1.000、1.000、0.999、1.000、1.000、1.000，RSD=0.05%。表明本方法重复性良好。 2.5 指纹图谱建立
取11批样品粉末（过3号筛），分别按“2.2”和“2.3”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图，确定指纹峰24个，将对照品溶液色谱峰的保留时间与供试品溶液色谱峰的保留时间以及紫外吸收光谱图进行比对（见图1、图2），鉴定供试品溶液中10个色谱峰，分别为甘草苷（4号峰）、甘草素（12号峰）、甘草酸（19号峰）、光甘草定（24号峰）、芹糖基异甘草苷（8号峰）、异甘草苷（9号峰）、刺甘草查尔酮（15号峰）、异甘草素（16号峰）和甘草查尔酮A（23号峰）。以出峰稳定、峰面积较大的19号色谱峰甘草酸为参照峰，将所得11批甘草药材的UPLC指纹图谱以AIA格式导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723版），选定样品S9的色谱图为参照图谱，设定时间漂移值为0.1，采用中位数法谱峰自动匹配，进行多点矫正，得到不同批次甘草药材样品叠加图谱及对照图谱（见图3、图4）。计算甘草药材样品指纹图谱与对照图谱（R）的相似度，结果显示波长237 nm相似度为0.940～0.988，波长355 nm相似度为0.831～0.982，见表3。
2.6 指纹图谱分析
11批甘草指纹图谱有24个共有峰，237 nm波长处以19号甘草酸峰为参照峰计算另外9个指纹峰的相对保留时间，355 nm波长处以8号芹糖基异甘草苷峰为参照峰计算另外13个指纹峰的相對保留时间结果见表4、表5。将相对保留时间的平均值作为规定值，11批甘草指纹图谱24个共有峰相对保留时间均在规定值±5%范围内。
3 讨论
本试验采用UPLC-H-Class PAD检测器进行全波长扫描，比较波长190～400 nm所得的指纹图谱色谱图，结果在237、355 nm波长处吸收较强，图谱在237、355 nm波长的整体图谱峰形较佳，成分信息更丰富，故确定指纹图谱的检测波长为237、355 nm。本试验考察了不同色谱柱及不同柱温（25、30、35 ℃）所得指纹图谱，结果表明，在30 ℃时，色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）的色谱图中色谱峰数量最多且分离效果最好。本试验比较了不同的流动相（甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%甲酸），结果显示乙腈- 0.05%磷酸分离效果较好，故选择乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱。在该色谱条件下增加有机相梯度洗脱比例，并延长洗脱时间至102 min，结果表明，51 min后无明显色谱峰，故将流动相洗脱时间确定为51 min。
本试验对不同提取方法、提取时间、提取溶剂及其体积进行了比较，结果表明，回流提取和超声提取，提取30、40 min，提取溶剂为70%乙醇和70%甲醇，提取溶剂体积为10、25、50 mL，对指纹图谱色谱峰强度与数目没有明显影响，故确定以70%乙醇10 mL超声提取30 min作为供试品溶液的制备方法。
本试验采用UPLC-PAD法梯度洗脱建立了甘草指纹图谱的分析方法，同时对色谱条件和供试品溶液的制备方法进行了优化，并进行了方法学考察，精密度、重复性、稳定性试验的相对保留时间RSD均小于2.50%，相对峰面积RSD均小于5.12%，表明该方法准确、可靠、重复性良好。对11批甘草药材样品的UPLC指纹图谱进行分析，得到24个共有峰，不同批次甘草UPLC指纹图谱的指纹峰数目及相对保留时间在规定值范围内，在237 nm波长处的相似度为0.940～0.988，355 nm波长处的相似度为0.831～0.982，表明11批甘草药材有较好的相似度。
本研究建立了甘草药材指纹图谱检测方法，并对不同批次的甘草药材指纹图谱进行分析比较，可为甘草药材内在的质量标准的建立及鉴别提供依据。
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（收稿日期：2018-12-29）
（修回日期：2019-03-05;编辑：陈静）
基金项目：国家自然科学基金青年基金（81503231）;国家中药标准化项目（ZYBZH-C-HEB-12）;北京市科技计划（Z161100001816022）
通讯作者：沈硕，E-mail：ssarticle2007@163.com
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